本文關鍵詞：S100A9對宮頸癌細胞的增殖和遷移的作用及其機制研究

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【摘要】：研究背景和目的S100家族是EF-手型鈣結合蛋白家族中最大的多基因家族,絕大部分作為鈣受體結合蛋白發(fā)揮作用,參與細胞結構的形成、酶活性的調節(jié)及細胞間信號傳導等。該家族中16個成員(包括S100A9)的基因定位于1號染色體長臂2區(qū)1帶(1q21),該區(qū)段穩(wěn)定性較差,易發(fā)生多種染色體重排,從而引起S100基因表達的失控。近年來發(fā)現(xiàn)S100異常表達于多種腫瘤組織中,且與疾病的分期和預后相關。S100A9(calgranulin B,MRP14)是S100蛋白家族的成員,最初發(fā)現(xiàn)表達于髓系細胞分化過程中,且以粒細胞和單核細胞中表達最高。越來越多研究證實多種腫瘤中也存在S100A9的高表達;我們前期發(fā)現(xiàn)S100A9促進肝癌HepG2細胞的增殖和侵襲、促進結直腸癌細胞增殖和轉移。這些結果都提示S100A9與腫瘤的發(fā)生發(fā)展較為相關。但其對腫瘤的作用及其機制、以及在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展中的意義等都尚待探討。宮頸癌發(fā)病率位于女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之首,直接蔓延為其最常見的播散方式,向前侵犯膀胱,向后侵犯直腸。其次,由于宮旁淋巴管豐富,淋巴轉移也是其擴散的主要途徑。腫瘤的擴散轉移給病人帶來極大的痛苦,甚至威脅生命。因此,明確宮頸癌遷移的具體機制對于降低患者病死率及改善預后具有重要意義。用基因芯片檢測宮頸鱗癌和癌旁宮頸組織的差異表達基因時,發(fā)現(xiàn)s100a9在宮頸鱗癌中的表達更高,提示s100a9可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。因此,本研究以宮頸癌細胞為實驗對象,觀察s100a9對其增殖及轉移的影響,并初步探討其分子機制,為闡明宮頸癌發(fā)生發(fā)展積累實驗依據,也可望為宮頸癌的診斷及治療提供新思路。方法1.下調和上調人s100a9基因表達的工具的制備:1-1干擾人s100a9基因表達的重組腺病毒adsis100a9及其對照腺病毒adsicontrol的構建、包裝:將針對人s100a9基因的干擾序列及其無關序列(對照)分別插入pses1中,然后轉化bj5183,與padeasy進行重組,挑選針尖樣大小單克隆菌落,提質粒,pacⅠ酶切鑒定后,將pacⅠ酶切后線性化的質粒在lipo2000輔助下轉染hek293細胞,進行病毒包裝。1-2用hek293細胞擴增所需重組腺病毒:包括adsis100a9、adsicontrol、攜帶人s100a9基因的重組腺病毒ads100a9及其對照adgfp。2.檢測三株宮頸癌細胞系(siha、caski和hela)中s100a9的內源性表達;分別用ads100a9和adsis100a9感染低表達和高表達s100a9的hela和siha細胞,再用rt-pcr和蛋白質印跡法確認被感染細胞中s100a9基因表達的上調和下調。3.s100a9對宮頸癌hela和siha細胞的增殖和遷移的影響:利用ads100a9和adsis100a9分別感染hela和siha細胞,分別用mtt法、劃痕愈合試驗和transwell試驗檢測其增殖及遷移能力的變化。4.s100a9對宮頸癌細胞上皮間質轉化(epithelial-mesenchymaltransition,emt)的影響:ads100a9和adsis100a9分別感染于hela和siha細胞后,蛋白質印跡法、免疫熒光檢測emt標志物e-cadherin、vimentin的水平變化。5.s100a9對宮頸癌細胞中wnt/β-catenin信號活性的影響:ads100a9和adsis100a9分別感染hela和siha細胞后,rt-pcr和蛋白質印跡法檢測wnt/β-catenin信號通路關鍵信號分子β-catenin(全部的及胞核內的)以及下游靶基因c-myc、snail和twist的表達。6.wnt/β-catenin信號通路在s100a9誘導宮頸癌細胞增殖和遷移的作用:聯(lián)合使用重組蛋白gst-hs100a9和β-catenin的重組干擾腺病毒(adsiβ-catenin)處理hela細胞,經mtt法和transwell試驗檢測其增殖和遷移能力的變化。7.wnt/β-catenin信號通路在s100a9誘導宮頸癌細胞發(fā)生emt中的作用:聯(lián)合使用重組蛋白gst-hs100a9和adsiβ-catenin處理hela細胞,蛋白質印跡法檢測emt標志物e-cadherin、vimentin水平的變化。結果1.成功構建、包裝和擴增實驗所需的病毒。1-1構建s100a9的sirna質粒并將其轉入bj5183細胞中與padeasy進行同源重組,再將重組質粒轉染hek293細胞后,熒光顯微鏡下可見細胞中的紅色熒光逐漸增強;于7-9d后收集細胞,反復凍融以裂解細胞,3次后收獲adsis100a9;相同方法獲得其對照腺病毒adsicontrol。至此,完成adsis100a9和adsicontrol的包裝。1-2將待擴增的病毒ads100a9、adgfp和adsis100a9、adsicontrol感染hek293細胞,24、36和48小時后的hek293細胞中分別可見逐漸增強的綠色熒光和紅色熒光;待80%以上細胞變圓、少數(shù)細胞脫落漂浮時收獲細胞,凍融裂解,收獲病毒,再進行逐輪擴增;病毒分裝凍存于-20℃?zhèn)溆谩?.這三株宮頸癌細胞系中,s100a9的表達以hela細胞最低,siha細胞略高于caski。ads100a9和adgfp感染hela細胞后,ads100a9組的細胞中s100a9mrna和蛋白水平顯著高于空白組和gfp組(即adgfp感染組);adsis100a9及adsicontrol感染siha細胞后,adsis100a9組的細胞中s100a9mrna和蛋白水平顯著低于空白組和sicontrol組(即adsicontrol感染組)。3.s100a9促進宮頸癌細胞的增殖和遷移。3-1s100a9促進宮頸癌細胞的增殖(mtt):1)hela細胞:按實驗設計用ads100a9等處理各組細胞;第1、2d,三組細胞之間的od490nm值(od值)無明顯差異;到第3d,空白組、gfp組及s100a9過表達組的od值分別為0.870±0.124、0.833±0.164和1.257±0.158,s100a9過表達組的od值顯著高于gfp組(p0.05);2)siha細胞:三組細胞在adsis100a9等相應處理后,其增殖能力在1d、2d無明顯差異;到第3d,空白組、sicontrol組及s100a9干擾組的od值分別為1.190±0.206、1.113±0.179和0.683±0.066,s100a9干擾組的od值顯著低于sicontrol組(p0.05)。3-2s100a9促進宮頸癌細胞的遷移。1)hela細胞:劃痕24h后,s100a9過表達組的劃痕愈合能力顯著高于空白組和gfp組;transwell試驗結果與之一致,即:s100a9過表達組的穿膜細胞數(shù)為(128.67±22.03)個,明顯高于空白組(74.67±14.05)和gfp組(66.00±14.42)個,差異具有顯著性(p0.05);2)siha細胞:劃痕36h后,s100a9干擾組的劃痕愈合能力明顯低于空白組和sicontrol組;transwell試驗結果與之一致,即:s100a9干擾組的穿膜細胞數(shù)為(77.50±7.77)個,明顯低于空白組(182.5±10.61)和sicontrol組(155.50±4.94),差異具有高度顯著性(p0.01)。4.s100a9促進宮頸癌細胞emt的發(fā)生。蛋白質印跡法和細胞免疫熒光檢測的結果一致顯示:s100a9過表達的hela細胞內的e-cadherin水平低于gfp組(p0.05),vimentin水平則高于gfp組(p0.01);s100a9干擾組的siha細胞內e-cadherin高于sicontrol組(p0.01),而vimentin水平則低于sicontrol組(p0.05)。5.s100a9增強宮頸癌細胞中wnt/β-catenin信號活性。1)s100a9過表達的hela細胞內總的及胞核內的β-catenin水平均高于gfp組,分別是gfp組的1.43倍和2.12倍(p0.01),并且該通路的下游靶基因c-myc、snail和twist的mrna水平也均高于gfp組(p0.05;p0.01;p0.05);2)s100a9表達下調的siha細胞內總的及胞核內的β-catenin水平則低于siControl組,分別為siControl組的27%(P0.001)和50%(P0.05),該通路下游的c-myc、Snail和Twist的mRNA水平也均低于siControl組(P0.01;P0.01;P0.001)。6.Wnt/β-catenin信號通路參與介導S100A9促進宮頸癌細胞增殖和遷移的作用。Adsiβ-catenin可下調β-catenin的表達,聯(lián)合使用GST-h S100A9和Adsiβ-catenin處理Hela細胞,我們發(fā)現(xiàn)β-catenin的下調能夠部分抑制S100A9誘導的Hela細胞增殖和遷移。7.Wnt/β-catenin信號通路參與介導S100A9促進宮頸癌細胞EMT的作用。聯(lián)合使用GST-hS100A9和Adsiβ-catenin處理Hela細胞,蛋白質印跡法檢測顯示β-catenin的下調能夠部分阻斷S100A9引起的E-cadherin的下調和Vimentin的上調。結論1.S100A9促進宮頸癌細胞的增殖和遷移。2.S100A9促進宮頸癌細胞的EMT。3.S100A9激活宮頸癌細胞中的Wnt/β-catenin信號通路。4.S100A9對Wnt/β-catenin信號通路的激活作用參與介導S100A9的促宮頸癌細胞增殖、遷移和EMT的活性。
【關鍵詞】：S100A9 宮頸癌 增殖 遷移 上皮間質轉化(EMT) Wnt/β-catenin信號通路
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照4-6
• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-20
• 前言20-23
• 參考文獻21-23
• 第一部分 重組腺病毒Adsi S100A9的制備及所需重組腺病毒的擴增23-39
• 1 材料與方法23-32
• 2 結果32-36
• 3 討論36-37
• 4 小結37
• 參考文獻37-39
• 第二部分 S100A9對宮頸癌細胞的增殖和遷移的影響39-45
• 1 材料與方法39-41
• 2 結果41-43
• 3 討論43-44
• 4 小結44
• 參考文獻44-45
• 第三部分 S100A9促宮頸癌細胞增殖、遷移的作用機制45-58
• 1 材料與方法45-48
• 2 結果48-54
• 3 討論54-55
• 4 小結55
• 參考文獻55-58
• 全文總結58-59
• 文獻綜述59-69
• 參考文獻64-69
• 致謝69-70
• 碩士期間發(fā)表的論文70

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前4條

1 游莉;徐蘭蘭;郭元元;鄒正渝;黎玉葉;孫雙雙;羅進勇;周蘭;;GST-hS100A9融合蛋白的原核表達、純化及鑒定[J];中國生化藥物雜志;2011年04期

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本文編號：880532