本文關(guān)鍵詞：雷公藤紅素在去勢抵抗型前列腺癌中潛在應(yīng)用的研究

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【摘要】：前列腺癌(Prostate Cancer,PC)是嚴(yán)重威脅男性健康的重大疾病之一。美國癌癥學(xué)會每年發(fā)布的全國衛(wèi)生統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,男性PC的死亡率僅次于肺癌及支氣管癌,連續(xù)高居各年齡段男性癌癥患者死亡率的第二位。雄激素(Androgen)及其受體(Androgen Receptor,AR)在前列腺癌的發(fā)生與演進(jìn)過程中發(fā)揮重要作用,因此,通過手術(shù)或藥物去勢抑制AR轉(zhuǎn)錄活性的雄激素剝奪治療(Androgen Deprivation Therapy,ADT)一直是前列腺癌治療的標(biāo)準(zhǔn)方法。盡管雄激素被剝奪可以暫時延緩患者的生存期,但大部分患者會在幾年內(nèi)發(fā)生癌癥復(fù)發(fā),發(fā)展為浸潤性更強(qiáng)的前列腺癌,即去勢抵抗性前列腺癌(Castration Resistant Prostate Cancer,CRPC)。AR基因包含8個外顯子和7個內(nèi)含子,全長約90kb,編碼約919個氨基酸殘基,一般由四個結(jié)構(gòu)域組成。其中NTD(N-Terminus domain)為外顯子A編碼的低保守的氨基端結(jié)構(gòu)域,又稱轉(zhuǎn)錄激活域(transcription activate domain,TAD)。DBD(DNA-binding domain)為一個相對較小的結(jié)構(gòu)域。此區(qū)域包括3個α螺旋組成的兩個鋅指結(jié)構(gòu)。AR的DBD區(qū)與其他類固醇受體的結(jié)合區(qū)域具有高度的同族性,通過此區(qū)AR識別并結(jié)合ARE,結(jié)合后的受體/激素復(fù)合物便可刺激轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的起始前復(fù)合物形成同時使該復(fù)合物穩(wěn)定,進(jìn)而將其與RNA聚合酶Ⅱ連接,活化信息核糖核酸mRNA的轉(zhuǎn)錄。LBD(ligand binding domain)與DBD區(qū)之間由一個含有核定位信號的鉸鏈區(qū)(flexible hinge)相連,主要功能為決定配體/受體之間的特異性結(jié)合,同時LBD區(qū)與NTD區(qū)為兩個完成AR活化調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的兩個主要結(jié)構(gòu)域。除此之外,LBD區(qū)還包含與熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)相互作用區(qū),二聚體化區(qū)域以及一個轉(zhuǎn)錄激活功能區(qū)AF2(activation function 2)。在體內(nèi)沒有雄激素存在時,LBD區(qū)一般與不同分子量的HSP等分子伴侶結(jié)合,使構(gòu)象維持在一種激素高親和狀態(tài),以寡聚體的形式存在于胞漿中,此時AR不具有轉(zhuǎn)錄活性。一旦AR與雄激素結(jié)合后,其空間構(gòu)象就發(fā)生了改變,同時與HSP解離,進(jìn)一步磷酸化,進(jìn)而使其與DNA的親和力增高,發(fā)生AR的活化�；罨院蟮腁R頭頭尾尾相接,形成同源二聚體,然后進(jìn)入靶細(xì)胞核,與靶基因啟動子中特定的DNA序列——雄激素反應(yīng)元件(androgen response element,ARE)相結(jié)合,再在TIF-2、CBP/p300、ARA70、ARA54、BAG-IL等共調(diào)節(jié)因子(coregulator)的作用下開啟轉(zhuǎn)錄調(diào)控,激活一系列與細(xì)胞生長發(fā)育、自動平衡、生殖代謝等活動相關(guān)的靶基因,如前列腺特異性抗原(PSA)、SLP、probasin等基因的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。這種ar的活化被稱之為配體(激素)依賴性ar的活化(ligand-dependentactivation),還有研究表明,在沒有發(fā)生基因突變的情況下,ar的活化還可以通過配體非依賴性(ligand-independentactivation)機(jī)制進(jìn)行�？梢�,ar的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能對于引發(fā)靶基因的有效轉(zhuǎn)錄,指導(dǎo)特定蛋白質(zhì)的合成及細(xì)胞的生長和分化具有重要意義。去勢抵抗的形成源于ar被重新激活。在crpc中,ar仍持續(xù)高表達(dá)且有轉(zhuǎn)錄活性;利用crpc動物模型證實(shí)crpc的生長依賴于ar的重新激活;去勢后crpc患者體內(nèi)有雄激素殘留,在crpc患者的腫瘤樣品中發(fā)現(xiàn)高水平的與雄激素合成相關(guān)的酶,說明腫瘤細(xì)胞內(nèi)可以合成雄激素。恩雜魯胺(enzalutamide)和阿比特龍(abiraterone)是美國食品與藥物管理局(fda)新批準(zhǔn)的第二代雄激素/雄激素受體(ar)拮抗藥物,分別抑制雄激素的合成及雄激素與受體的結(jié)合。abiraterone抑制雄激素合成必須的cyp17a1酶活性,enzalutamide是一種更有效的雄激素與ar結(jié)合的拮抗劑。以enzalutamide和abiraterone為代表的第二代荷爾蒙治療藥物進(jìn)入了iii期臨床試驗。臨床試驗表明,去勢抵抗性前列腺癌患者表達(dá)ar剪接變異體ar-v7。ar-v7由第3外顯子變異剪接形成。由于ar-v7缺少lbd,使得恩雜魯胺和阿比特龍作用脫靶,造成前列腺癌演進(jìn)為轉(zhuǎn)移型去勢抵抗前列腺癌(mcrpc)。此外,arlbd的體細(xì)胞突變(f876l),使得enzalutamide的作用由雄激素拮抗轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に丶せ睢Ｒ詔ok-001(galeterone)為代表的第三代雄激素剝奪治療最近進(jìn)入了臨床試驗,其作用不僅是雄激素拮抗,還引起ar降解,因此避免了因ar突變或變異剪接引起的抗藥性。對恩雜魯胺和阿比特龍不敏感的前列腺癌患者仍然對甾醇類抗雄激素藥物galeterone有強(qiáng)烈反應(yīng),galeterone目前在臨床iii期試驗,是第一個在ar-v7陽性mcrpc患者用于精準(zhǔn)治療的雄激素剝奪藥物。雷公藤紅素(celastrol)是從傳統(tǒng)中藥雷公藤根部分離的三萜烯類化合物,其化學(xué)結(jié)構(gòu)與tok-001相似,也作用于ar降解途徑。與配體(激素)結(jié)合前,ar主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,與分子伴侶(熱休克蛋白hsp90)結(jié)合形成異聚體。雷公藤紅素能抑制hsp90的atp結(jié)合活性,或破壞hsp90分子伴侶復(fù)合物的形成,引起客戶蛋白ar的不穩(wěn)定。我們發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素作用于前列腺癌細(xì)胞引起蛋白酶calpain的激活,造成ar蛋白的切割降解。雷公藤紅素在前列腺癌細(xì)胞和動物模型中清除ar蛋白,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和腫瘤生長抑制,對轉(zhuǎn)移性crpc的生長抑制率達(dá)93%,顯示良好的對crpc治療的潛在應(yīng)用。鑒于雷公藤紅素能夠引起ar蛋白的降解,其化學(xué)結(jié)構(gòu)與gal相似,在本研究中我們探究了雷公藤紅素對AR-V7陽性前列腺細(xì)胞的作用。與之前的研究相符,雷公藤紅素能抑制AR蛋白表達(dá),同時還能誘導(dǎo)22Rv1前列腺癌細(xì)胞AR-V7蛋白的表達(dá)下調(diào)。用5μmol/L雷公藤紅素在不同時間下處理22RV1細(xì)胞。通過western blot檢測了全長AR以及AR-V7的表達(dá)。結(jié)果顯示,AR全長和AR-V7的表達(dá)均受到下調(diào),并且呈現(xiàn)時間依賴特性。24小時藥物處理后,全長AR以及AR-V7的表達(dá)完全消失。經(jīng)過雷公藤紅素處理后,AR-V7和全長AR在mRNA表達(dá)水平都沒有降低,表明AR-V7的減少不是由于AR的翻譯也不是由于AR-V7的拼接改變導(dǎo)致的。在雷公藤紅素處理后通過Western blot對凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,PARP、SpectrinαII以及Calpastatin蛋白均受到切割,同時在細(xì)胞形態(tài)上能夠檢測到膜皺縮等凋亡細(xì)胞特性。綜上,我們確認(rèn)了雷公藤紅素能夠抑制22Rv1細(xì)胞中AR-V7的表達(dá),并且能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡�？剐奂に厮幬锬軐�(dǎo)致雄激素胞質(zhì)定位,因此我們研究了雷紅素處理后的AR-V7核轉(zhuǎn)位。經(jīng)過雷公藤紅素處理后,我們檢測了AR以及AR-V7的核轉(zhuǎn)位。與AR不同,AR-V7定位在細(xì)胞核中,雷公藤紅素處理并未引起AR-V7出核。從PARP以及SpectrinαII的切割、凋亡形態(tài)的改變可以證實(shí),AR-V7的降解伴隨著細(xì)胞和內(nèi)凋亡蛋白的激活。PARP以及SpectrinαII的切割表明Caspase-3的激活。Caspase-3是凋亡的主要執(zhí)行者,當(dāng)細(xì)胞凋亡被caspase-3抑制劑z-VAD-FMK抑制時,AR-V7的降解也被抑制,這表明了caspase-3促進(jìn)了雷公藤紅素誘導(dǎo)的AR-V7降解。Western blot以及活性檢測實(shí)驗都證實(shí)了z-VAD-FMK有效抑制caspase-3活性。另外,雷公藤紅素誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)改變也能夠被z-VAD-FMK抑制。這些結(jié)果均表明,雷公藤紅素誘導(dǎo)的凋亡對雷公藤紅素誘導(dǎo)的AR-V7降解至關(guān)重要。我們的研究結(jié)果表明了雷公藤紅素能夠誘導(dǎo)AR-V7的降解,可以克服臨床應(yīng)用的雄激素拮抗劑的脫靶效應(yīng),是一種潛在的用于AR-V7陽性前列腺癌患者的治療手段。
【關(guān)鍵詞】：雄激素受體 雄激素受體剪接變異體-7 雷公藤紅素 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-10
• Chapter 1 Introduction10-21
• 1.1 Research origin10
• 1.2 Research purpose and significance of subject10-11
• 1.3 Background11-19
• 1.3.1 Development of Prostate Cancer11-13
• 1.3.2 Androgen/androgen receptor signaling13-15
• 1.3.3 AR splice variants15-16
• 1.3.4 Treatment of prostate cancer16-17
• 1.3.5 Celastrol potential implications for prostate cancer treatment17-19
• 1.4 Research route19-21
• Chapter 2 Materials and Methods21-27
• 2.1. Materials and Reagents21-22
• 2.1.1 Materials21
• 2.1.2 Reagents21
• 2.1.3. Polyacrylamide gel composition21
• 2.1.4 Solution21-22
• 2.1.5 Devices used in this study and its manufacturer established22
• 2.2. Methods22-27
• 2.2.1. Culture media22-23
• 2.2.2. Cell culture23
• 2.2.3. Maintenance of cells23
• 2.2.4 RNA Isolation23-24
• 2.2.5 Real-time quantitative reverse transcription-PCR24-25
• 2.2.6 Protein Extraction25
• 2.2.7. Western blot25-27
• Chapter 3 Effects of Celastrol on AR-V7 depletion27-33
• 3.1. Celastrol induced AR-V7 decrease in 22Rv1 cell27-29
• 3.1.1 AR-V7 levels analyzed by Western Blotting27-28
• 3.1.2 AR-V7 mRNA expression28-29
• 3.2 Apoptotic effects of celastrol in 22Rv1 cells29-31
• 3.3 Morphological changes after Celastrol treatment31-32
• 3.4. Summary32-33
• Chapter 4 Effects of cholesterol on AR-V7 translocation33-35
• 4.1. AR-V7 nucleus and cytosol translocation33
• 4.2. Apoptotic effects in nucleus33-34
• 4.3. Summary34-35
• Chapter 5 Mechanisms of Celastrol-induced AR-V7 loss35-37
• 5.1 Caspase-3 effects of AR-V7 loss (Evaluation on apoptotic)35-36
• 5.2. Summary36-37
• Conclusions37-38
• References38-44
• Acknowledgements44

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本文編號：872002