本文關(guān)鍵詞：腸道微生態(tài)與異甘草素抗炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌作用的相關(guān)性研究

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【摘要】：背景腸道菌群失衡與炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌(CAC)的發(fā)病密切相關(guān)。一些傳統(tǒng)中藥具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。異甘草素(Isoliquiritigenin,ISL)是從甘草中提取的一種查爾酮化合物。研究發(fā)現(xiàn)異甘草素具有多種抗癌活性。然而,目前尚未有關(guān)于異甘草素在抗結(jié)直腸癌和對腸道微生物的影響方面的相關(guān)研究報道。目的(1)對比四種從糞便中提取微生物基因組DNA的方法,從中選取高效且能更為客觀全面反映糞便中微生物群落特征的提取方法。(2)分析小鼠糞便及腸道各部位內(nèi)容物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異,探討糞便取樣研究腸道微生物與疾病關(guān)系的科學(xué)性和客觀性,為研究腸道微生物與疾病相關(guān)實(shí)驗提供依據(jù)。(3)構(gòu)建氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)/葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)小鼠模型,通過細(xì)菌16S rRNA的T-RFLP、熒光定量PCR和高通量測序技術(shù)分析對照組和模型組小鼠腸道微生物群落結(jié)構(gòu),闡述AOM/DSS模型小鼠CAC發(fā)展過程中的微生態(tài)演變規(guī)律;通過不同劑量異甘草素干預(yù)AOM/DSS模型,評估異甘草素對CAC發(fā)展的干預(yù)作用,并分析異甘草素對腸道微生態(tài)演變的影響。方法(1)在第一部分中,采用本實(shí)驗室優(yōu)化的GITC法、Tiangen商業(yè)試劑盒、Omega商業(yè)試劑盒和廣泛應(yīng)用的蛋白酶K-CTAB法從糞便樣品中提取微生物總DNA,比較這四種方法提取的DNA的濃度、純度和經(jīng)PCR-DGGE(變性梯度凝膠電泳)分析所代表樣品的微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)。(2)在第二部分中,利用末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)和熒光定量PCR技術(shù)(qPCR)對BALB/c小鼠腸道不同部位(十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸)內(nèi)容物及糞便中細(xì)菌群落組成和豐度進(jìn)行比較,分析細(xì)菌群落在小鼠糞便及腸道各部位的分布差異。(3)在第三部分中:1)設(shè)置氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉(AOM/DSS)誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌BALB/c小鼠組(CACM)、三個不同濃度異甘草素干預(yù)AOM/DSS誘導(dǎo)炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌小鼠組(150 mg/kg,CIH;75 mg/kg,CIM;30 mg/kg,CIL)、空白對照組(CK)和異甘草素對照組(ISL+CK)。2)利用熒光定量PCR分析各組小鼠腸道上皮炎性細(xì)胞因子(IL-6、IL-10、TNF-α、IL-1β、IKKβ)以及炎癥因子COX-2的變化;將腸組織切片進(jìn)行HE染色分析各組小鼠腸上皮病理變化,評估AOM/DSS誘導(dǎo)炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌進(jìn)程以及異甘草素對小鼠腸道的保護(hù)作用。3)通過末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)和高通量測序方法分析小鼠腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)演變,分析異甘草素對炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌小鼠腸道菌群的影響。4)結(jié)合小鼠腸上皮組織病理特征和腸道菌群結(jié)構(gòu)特點(diǎn),綜合分析腸道菌群在異甘草素干預(yù)炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。結(jié)果(1)四種從糞便中提取糞便中微生物基因組DNA對比結(jié)果:1)商業(yè)試劑盒提取的DNA純度最高但是濃度最低;蛋白酶K-CTAB所得的DNA濃度最高但是純度最低;GITC法所得DNA的濃度高于商業(yè)試劑盒,純度高于蛋白酶K-CTAB法。2)細(xì)菌16S rRNA的PCR-DGGE分析結(jié)果表明,GITC法提取得到DNA所代表細(xì)菌的豐富度和多樣性顯著高于其他三種方法。本實(shí)驗室所優(yōu)化的GITC法可最為全面地反映小鼠糞便細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成。(2)小鼠糞便及腸道各部位內(nèi)容物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果:1)糞便與直腸、結(jié)腸中優(yōu)勢片段均為244 bp、255 bp和449 bp,而小腸內(nèi)容物(十二指腸、空腸及回腸)的優(yōu)勢片段則為60 bp、73 bp、261 bp、268 bp和272 bp,且小腸各部位之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。糞便樣品可客觀反映小鼠結(jié)直腸部位腸道菌群組成。2)十二指腸和空腸內(nèi)容物中的細(xì)菌豐度較低,分別為6.9 log(copies)/g和8.3log(copies)/g,而糞便中細(xì)菌豐度高達(dá)11.8 log(copies)/g,約2倍于十二指腸細(xì)菌豐度,顯著高于十二指腸和空腸(P0.05),與大腸各部位及回腸內(nèi)容物細(xì)菌豐度相當(dāng),差異不顯著(P0.05)。(3)異甘草素通過調(diào)節(jié)腸道微生物抑制小鼠炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌結(jié)果:1)組織病理學(xué)分析表明異甘草素可顯著下調(diào)與炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子并抑制AOM/DSS小鼠模型中腫瘤的發(fā)生率。2)基于T-RFLP的CA分析表明,在AOM/DSS誘導(dǎo)的CAC發(fā)展過程中,小鼠腸道微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化,而ISL能在一定程度上抑制CAC對腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,且ISL不會改變正常小鼠腸道微生物群落結(jié)構(gòu)。3)基于細(xì)菌16S rRNA的高通量測序結(jié)果表明,腸道微生物在AOM/DSS誘導(dǎo)的CAC小鼠腸道和異甘草素干預(yù)下的CAC小鼠腸道中均發(fā)生顯著變化。與健康小鼠相比,CAC發(fā)生時擬桿菌門(Bacteroidetes)豐度降低,厚壁菌門(Firmicutes)豐度增加;異甘草素能逆轉(zhuǎn)這種菌門水平上的不平衡。抗CAC的同時,異甘草素能調(diào)節(jié)腸道菌群,尤其是在科的水平上:異甘草素顯著下調(diào)毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)和理研菌科(Rikenellaceae)的豐度,增加螺桿菌科(Helicobacteraceae)的豐度;除毛螺旋菌科外,經(jīng)過異甘草素治療后的小鼠腸道菌群與健康小鼠腸道菌群在科分類水平上無顯著差異。在屬的水平上,異甘草素降低了一些機(jī)會致病菌的豐度,如埃希菌屬(Escherichia)和腸球菌屬(Enterococcus);同時異甘草素增加了一些丁酸鹽產(chǎn)生菌的豐度,如Butyricicoccus、Clostridium和Ruminococcus。結(jié)論(1)商業(yè)試劑盒提取的糞便微生物基因組DNA純度較高,但是濃度較低且成本高,適合于高通量測序等需要高純度低濃度的微生物分析方法;本實(shí)驗室優(yōu)化的GITC法提取的糞便微生物總DNA能更全面地反應(yīng)腸道微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu),且成本較低,因此適合于實(shí)驗室對實(shí)驗樣品的一般性分析研究。(2)糞便和大腸各部位內(nèi)容物的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)個體差異較小腸小,適合進(jìn)行腸道微生態(tài)與疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)科學(xué)研究;糞便與大腸特別是結(jié)直腸部位細(xì)菌群落組成相似,可通過糞便取樣進(jìn)行該部位的微生物生態(tài)學(xué)相關(guān)分析。(3)明確了異甘草素的抗炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌的作用。在異甘草素抑制炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌的過程中,腸道微生物群落結(jié)構(gòu)亦發(fā)生顯著變化。AOM/DSS誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌導(dǎo)致的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的改變可被異甘草素在一定程度上逆轉(zhuǎn)。這種逆轉(zhuǎn)過程包括一些益生菌的增加,如Prevotella、Butyricicoccus、Clostridium和Ruminococcus;一些機(jī)會致病菌的減少,如Escherichia和Enterococcus。異甘草素在抗癌過程中改變的這些微生物可能會協(xié)同其抗癌效果。同時,本研究對傳統(tǒng)中藥在發(fā)揮抗癌活性時也會調(diào)節(jié)腸道菌群方面有提供了新的證據(jù)。以后更多的研究將聚焦于異甘草素抗癌的具體分子機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：BALB/c小鼠 氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉 末端限制性片段長度多態(tài)性分析 高通量測序 腸道菌群 炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-13
• 前言13-16
• 第一部分 對比四種提小鼠糞便中微生物基因組DNA的方法16-30
• 1 研究材料16-18
• 2 實(shí)驗方法18-26
• 3 結(jié)果26-30
• 第二部分 小鼠糞便及腸道各部位內(nèi)容物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異分析30-41
• 1 研究材料30-31
• 2 實(shí)驗方法31-36
• 3 結(jié)果36-41
• 第三部分 異甘草素通過調(diào)節(jié)腸道微生物抑制小鼠炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌41-66
• 1 研究材料41-44
• 2 實(shí)驗方法44-51
• 3 結(jié)果51-66
• 討論66-71
• 結(jié)論71-72
• 參考文獻(xiàn)72-80
• 綜述：結(jié)直腸癌潛在微生物標(biāo)記物的研究進(jìn)展80-89
• 參考文獻(xiàn)85-89
• 附錄89-91
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況91-92
• 致謝92-93
• 個人簡歷93

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 汪云,曹玉華;毛細(xì)管電泳法測定甘草中的甘草素和異甘草素[J];分析測試學(xué)報;2004年04期

2 張晶;楊靜;吳基良;詹春;張琳;;異甘草素脂質(zhì)體的制備及穩(wěn)定性考察[J];中國醫(yī)院藥學(xué)雜志;2005年11期

3 慕春海;韓博;李超鵬;陳文;;多壁碳納米管對異甘草素和甘草素的選擇性吸附[J];石河子大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2010年04期

4 黃繼偉;凌新龍;林海濤;;異甘草素的簡便合成研究[J];時珍國醫(yī)國藥;2012年10期

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本文編號：871561