本文關(guān)鍵詞：Elp3依賴HAT活性參與肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： Elp3 序列敲除 遷移侵襲 損傷修復(fù)

【摘要】：目的:構(gòu)建Elp3序列敲除重組表達(dá)質(zhì)粒,通過與過表達(dá)Elp3及干擾Elp3質(zhì)粒組對比,研究Elp3蛋白在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用與其HAT結(jié)構(gòu)域和參與Elongator復(fù)合體構(gòu)建的關(guān)系。方法:1.測序及雙酶切鑒定PIRES2-EGFP-Elp3及四個序列敲除重組表達(dá)質(zhì)粒。2.RT-PCR、western blot鑒定293a細(xì)胞及HepG2細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染各組質(zhì)粒后,目的基因mRNA,蛋白表達(dá)。3.通過Real-time PCR、western blot檢測HepG2細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染各組質(zhì)粒后,Elp3 mRNA,蛋白表達(dá)水平。4.CCK-8檢測各組細(xì)胞增殖能力的變化情況。5.劃痕實驗檢測各組細(xì)胞遷移能力的變化情況。6.Transwell實驗檢測各組細(xì)胞遷移、侵襲能力的變化情況。7.以O(shè)TM為指標(biāo),彗星電泳檢測輻照后各組細(xì)胞DNA損傷修復(fù)情況。8.Western blot檢測各組細(xì)胞Elp3、Elp4、AKT、p-AKT、MMP2、MMP9等指標(biāo)的變化情況。結(jié)果:1.測序及雙酶切鑒定表明,插入表達(dá)重組載體中的目的基因序列準(zhǔn)確,長度無誤:elp3-d1(1374bp),elp3-d2(1110bp),elp3-d3(1239bp),elp3-d4(636bp),elp3(1692bp)。2.RT-PCR檢測結(jié)果表明,重組表達(dá)載體中的目的基因能夠表達(dá)出正確的mRNA;western blot檢測結(jié)果表明,重組表達(dá)載體中的目的基因在293a細(xì)胞及HepG2細(xì)胞中均能正確表達(dá)目的蛋白:Elp3-d1(50kDa),Elp3-d2(40k Da),Elp3-d3(45kDa),Elp3-d4(27kDa),Elp3(62kDa)。3.Real-time PCR檢測及Western blot檢測結(jié)果表明,表達(dá)載體中序列基因表達(dá)1出的目的蛋白并沒有影響細(xì)胞中內(nèi)源性elp3mrna、蛋白表達(dá),elp3-d1、elp3-d2、elp3-d3、elp3-d4組表達(dá)量與hepg2組比,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義;elp3過表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)elp3蛋白表達(dá)增高,elp3干擾組(elp3i)細(xì)胞內(nèi)elp3蛋白表達(dá)減少。4.cck-8檢測結(jié)果顯示,相比于hepg2組,elp3干擾組及過表達(dá)elp3-d1蛋白的細(xì)胞增殖能力顯著下調(diào);過表達(dá)elp3、elp3-d3蛋白的細(xì)胞增值能力顯著增強(qiáng);過表達(dá)elp3-d2、elp3-d4蛋白的細(xì)胞無顯著差異。5.劃痕實驗檢測結(jié)果顯示,相比于hepg2細(xì)胞,elp3干擾組及過表達(dá)elp3-d1蛋白的細(xì)胞遷移能力下降;過表達(dá)elp3、elp3-d3蛋白的細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng);過表達(dá)elp3-d2、elp3-d4蛋白的細(xì)胞無顯著差異。6.transwell實驗檢測結(jié)果顯示,相比于hepg2細(xì)胞組,elp3干擾組及過表達(dá)elp3-d1蛋白細(xì)胞,遷移能力減弱,穿膜侵襲能力下調(diào);過表達(dá)elp3、elp3-d3蛋白的細(xì)胞遷移能力增強(qiáng),穿膜侵襲能力增強(qiáng);過表達(dá)elp3-d2、elp3-d4蛋白的細(xì)胞無顯著差異。7.彗星電泳檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),8gy/min劑量輻照后,相比于hepg2細(xì)胞,elp3干擾組及過表達(dá)elp3-d1蛋白的細(xì)胞,在損傷后修復(fù)速度及修復(fù)能力上下降明顯;過表達(dá)elp3、elp3-d3蛋白的細(xì)胞修復(fù)速度提高,修復(fù)能力增強(qiáng);過表達(dá)elp3-d2、elp3-d4蛋白的細(xì)胞無顯著差異。8.westernblot檢測各組細(xì)胞,elp3、elp4、akt、p-akt、mmp2、mmp9表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),相比于hepg2細(xì)胞組,elp3干擾組及過表達(dá)elp3-d1蛋白的細(xì)胞組,akt激活水平及下游mmp2、mmp9蛋白表達(dá)水平略有下調(diào);過表達(dá)elp3、elp3-d3蛋白的細(xì)胞組,akt激活水平及下游mmp2、mmp9蛋白表達(dá)量提高;過表達(dá)elp3-d2、elp3-d4蛋白的細(xì)胞組內(nèi)相關(guān)蛋白無顯著差異。結(jié)論:1.成功構(gòu)建elp3過表達(dá)質(zhì)粒及序列敲除重組表達(dá)質(zhì)粒,正確表達(dá)出目的蛋白。2.重組表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)出的目的蛋白不影響elp3內(nèi)源性表達(dá)。3.elp3蛋白在肝癌細(xì)胞中促進(jìn)增殖,促進(jìn)遷移侵襲,促進(jìn)dna損傷修復(fù)等作用依賴其hat活性。4.elp3激活akt信號通路依賴elongator復(fù)合體結(jié)構(gòu)完整性及hat功能完整性。5.Elp3參與細(xì)胞多種活動,可能是通過乙�；鸹蚣せ疃侵苯幼饔糜谛盘柾吠瓿傻�。
【關(guān)鍵詞】：Elp3 序列敲除 遷移侵襲 損傷修復(fù)
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 引言12-14
• 第一部分 Elp3重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定14-35
• 1 材料與方法15-22
• 1.1 材料15
• 1.2 主要儀器設(shè)備15-16
• 1.3 實驗方法16-22
• 2 實驗結(jié)果22-33
• 2.1 預(yù)測確定敲除序列序列并成功構(gòu)建真核表達(dá)載體22-25
• 2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定25-26
• 2.3 重組質(zhì)粒的基因測序鑒定26-30
• 2.4 RT-PCR檢測重組質(zhì)粒相關(guān)基因表達(dá)30
• 2.5 Western blot檢測重組質(zhì)粒蛋白表達(dá)30-33
• 3 討論33-35
• 第二部分 Elp3促進(jìn)HCC細(xì)胞遷移侵襲及DNA損傷修復(fù)35-58
• 1 材料與方法36-44
• 1.1 材料36-37
• 1.2 主要儀器設(shè)備37
• 1.3 實驗方法37-44
• 2 實驗結(jié)果44-55
• 2.1 Real time PCR檢測瞬時轉(zhuǎn)染后Elp3 mRNA表達(dá)情況44-45
• 2.2 Western blot檢測瞬時轉(zhuǎn)染后Elp3蛋白表達(dá)情況45-46
• 2.3 CCK-8 檢測瞬時轉(zhuǎn)染重組表達(dá)質(zhì)粒后Hep G2細(xì)胞增殖情況46-47
• 2.4 劃痕實驗檢測HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后細(xì)胞的遷移能力47-48
• 2.5 transwell實驗檢測HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后細(xì)胞的遷移侵襲能力48-49
• 2.6 ~(60)Coγ射線輻照的最適劑量49-50
• 2.7 彗星電泳分析轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒對基因組的影響50-52
• 2.8 HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后侵襲遷移相關(guān)蛋白表達(dá)水平52-55
• 3 討論55-58
• 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-62
• 綜述:Elongator復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能62-73
• 參考文獻(xiàn)69-73
• 展望73-74
• 本文受以下基金資助74-75
• 縮略詞表75-76
• 致謝76-77

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