本文關(guān)鍵詞：Brd4選擇性抑制劑JQ1治療惡性腦膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：【研究背景】:溴結(jié)構(gòu)域(Bromodomain)是一種保守的蛋白結(jié)構(gòu)域,它能夠與組蛋白中的乙�；嚢彼嵯嘟Y(jié)合。BET(Bromodomain and extraterminal)蛋白是一種包含溴結(jié)構(gòu)域的蛋白。BET蛋白可以選擇性地與組蛋白尾部的乙�；嚢彼釟埢嘟Y(jié)合。通過這種相互作用,包含溴結(jié)構(gòu)域的蛋白能夠使細(xì)胞核大分子復(fù)合體到染色質(zhì)的特定區(qū)域,從而調(diào)節(jié)一系列重要的生物學(xué)活動(dòng)。BET家族包括Brd2、Brd3、Brd4和Brdt,其中Brd4又包含了Brd4A、Brd4B、Brd4C三種亞型。在BET家族中研究最多最廣泛的則是Brd4。BET蛋白的致癌功能在睪丸核蛋白中線癌中第一次被證實(shí)。最近有報(bào)道證實(shí),通過si RNA文庫篩選發(fā)現(xiàn),在急性髓性白血病中沉默Brd4基因會(huì)導(dǎo)致c-Myc表達(dá)下調(diào),減少白血病干細(xì)胞的數(shù)量,從而抑制癌癥的進(jìn)一步發(fā)展。近些年Brd4的小分子抑制劑發(fā)展迅速,其中包括了JQ1、I-BET 151和CPI203等。JQ1是Brd4蛋白的小分子抑制劑。它可以競爭性的與BET溴結(jié)構(gòu)域相結(jié)合,使BET蛋白從染色質(zhì)的乙�；嚢彼嵘现脫Q下來。無論體外實(shí)驗(yàn)還是體內(nèi)實(shí)驗(yàn),在多種造血系統(tǒng)癌癥和NUT中線癌中JQ1都有效抑制了BET溴結(jié)構(gòu)域,抗癌作用顯著。研究表明,JQ1可以使c-Myc的表達(dá)顯著下調(diào),而c-Myc在惡性腦膠質(zhì)瘤小鼠模型中發(fā)揮了重要的促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移和維持惡性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞活性的作用,提示應(yīng)用JQ1治療惡性腦膠質(zhì)瘤具有廣闊的應(yīng)用前景�！灸康摹�:為了探討B(tài)rd4選擇性抑制劑JQ1對于惡性腦膠質(zhì)瘤始動(dòng)細(xì)胞的作用及機(jī)制,采用JQ1作用于小鼠腦膠質(zhì)瘤始動(dòng)細(xì)胞CSC1589,實(shí)驗(yàn)觀察JQ1對CSC1589細(xì)胞增殖能力、自我更新能力和凋亡的影響,證實(shí)Brd4可以作為惡性膠質(zhì)瘤潛在的藥物靶點(diǎn),并且初步探討其作用機(jī)制�！痉椒ā�:CCK8、細(xì)胞生長計(jì)數(shù)、神經(jīng)球成球能力實(shí)驗(yàn)檢測Brd4選擇性抑制劑JQ1對小鼠腦膠質(zhì)瘤始動(dòng)細(xì)胞CSC1589細(xì)胞增殖和自我更新能力的影響。免疫熒光染色檢測JQ1對小鼠腦膠質(zhì)瘤始動(dòng)細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)情況的影響。Annexin V-FITC流式細(xì)胞術(shù)、Hochest染色檢測JQ1對CSC1589細(xì)胞凋亡的影響。PI流式細(xì)胞術(shù)檢測JQ1對腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤周期的影響。q-PCR和Western blot檢測CSC1589細(xì)胞中Brd4下游基因c-Myc及凋亡、周期相關(guān)基因的表達(dá)水平。【結(jié)果】:通過CCK8實(shí)驗(yàn)我們分別在24小時(shí)和48小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測了不同濃度的JQ1對小鼠腦膠質(zhì)瘤始動(dòng)細(xì)胞CSC1589增殖能力的影響。結(jié)果顯示,JQ1藥物濃度越高對細(xì)胞生長的抑制作用越明顯,呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們選擇的JQ1藥物濃度為125 nmol/L和250 nmol/L。細(xì)胞生長計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與對照組相比,JQ1加藥組細(xì)胞數(shù)量明顯減少,這表明JQ1能夠抑制腦膠質(zhì)瘤始動(dòng)細(xì)胞的增殖,并且高濃度的JQ1(250nmol/L)抑制效果更為明顯。神經(jīng)球成球能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對照組相比,JQ1加藥組神經(jīng)球個(gè)數(shù)明顯減少,實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示JQ1有效地抑制了腫瘤始動(dòng)細(xì)胞的自我更新能力,并且高濃度的JQ1(250 nmol/L)抑制效果更為明顯。Annexin V-FITC流式細(xì)胞術(shù)和Hochest染色檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示,與對照組相比,加入JQ1后凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多,JQ1有效誘導(dǎo)了CSC1589細(xì)胞的凋亡。PI流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的結(jié)果顯示,JQ1使細(xì)胞周期停滯在G1期的比例增加,S期減少,使細(xì)胞不能正常進(jìn)入分裂期。免疫熒光染色結(jié)果顯示,與對照組相對比JQ1加藥組干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin的表達(dá)量明顯減少,實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示了JQ1可以有效地降低腦膠質(zhì)瘤始動(dòng)細(xì)胞CSC1589的干細(xì)胞活性。q-PCR結(jié)果顯示,JQ1加藥組Brd4的下游基因c-Myc的m RNA表達(dá)受到了抑制,促凋亡基因的m RNA表達(dá)水平明顯高于對照組,抗凋亡基因的m RNA表達(dá)水平低于對照組,周期相關(guān)基因的m RNA表達(dá)水平低于對照組。Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,JQ1加藥組Brd4的下游基因c-Myc的蛋白表達(dá)水平明顯減少,抗凋亡基因Bcl-2的蛋白表達(dá)明顯較少,促凋亡基因Bax的表達(dá)明顯增多�！窘Y(jié)論】:Brd4選擇性抑制劑JQ1可以有效地抑制腦膠質(zhì)瘤始動(dòng)細(xì)胞的增殖和自我更新能力,促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡,使細(xì)胞產(chǎn)生周期阻滯現(xiàn)象,最終能夠達(dá)到抑制腫瘤的目的。本研究揭示了Brd4可以作為惡性膠質(zhì)瘤潛在的藥物靶點(diǎn),Brd4選擇性抑制劑JQ1可以有效的發(fā)揮治療惡性腦膠質(zhì)瘤的作用。
【關(guān)鍵詞】：腦膠質(zhì)瘤 Brd4 BET蛋白 JQ1 凋亡
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41
【目錄】：

• 前言4-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-17
• 英文縮寫詞表17-18
• 第一章 文獻(xiàn)綜述18-34
• 1.1 惡性腦膠質(zhì)瘤的分級、發(fā)病機(jī)制和治療現(xiàn)狀18-19
• 1.2 腫瘤的表觀遺傳學(xué)研究19-20
• 1.3 溴結(jié)構(gòu)域、BET家族及Brd420-27
• 1.3.1 溴結(jié)構(gòu)域20
• 1.3.2 BET家族的成員及生物功能20-21
• 1.3.3 Brd4的生理功能21-22
• 1.3.4 Brd4溴結(jié)構(gòu)域與組蛋白相互作用22-23
• 1.3.5 BET與非組蛋白間的相互作用23-25
• 1.3.6 信號通路調(diào)控25-27
• 1.4 BET小分子抑制劑27-34
• 1.4.1 BET小分子抑制劑的概述及分類27-28
• 1.4.2 BET小分子抑制劑在多種癌癥中的作用28-32
• 1.4.3 其他作用32-34
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法34-46
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料34-36
• 2.1.1 所用細(xì)胞株34
• 2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備34-35
• 2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑35-36
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法36-46
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法36
• 2.2.2 CCK8法檢測JQ1對CSC1589細(xì)胞增殖能力的影響36
• 2.2.3 細(xì)胞生長計(jì)數(shù)檢測JQ1對CSC1589細(xì)胞增殖能力的影響36-37
• 2.2.4 神經(jīng)球成球能力實(shí)驗(yàn)檢測JQ1對CSC1589細(xì)胞自我更新能力的影響37-38
• 2.2.5 Annexin V-FITC流式細(xì)胞術(shù)檢測JQ1對CSC1589細(xì)胞凋亡的影響38
• 2.2.6 PI流式細(xì)胞術(shù)檢測JQ1對CSC1589細(xì)胞周期的影響38-39
• 2.2.7 q-PCR方法檢測腫瘤細(xì)胞中Brd4及相關(guān)基因的m RNA表達(dá)39-41
• 2.2.8 Western blot檢測蛋白表達(dá)情況41-43
• 2.2.9 免疫熒光染色43-44
• 2.2.10 Hoechst染色方法44-45
• 2.2.11 統(tǒng)計(jì)分析45-46
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-55
• 3.1 JQ1抑制CSC1589細(xì)胞增殖和自我更新能力46-48
• 3.1.1 CCK8檢測JQ1對CSC1589細(xì)胞增殖的影響46-47
• 3.1.2 細(xì)胞生長計(jì)數(shù)法檢測JQ1對CSC1589細(xì)胞增殖的影響47
• 3.1.3 神經(jīng)球成球能力實(shí)驗(yàn)檢測JQ1對CSC1589細(xì)胞自我更新能力的影響47-48
• 3.2 JQ1對于CSC1589細(xì)胞凋亡的影響48-50
• 3.2.1 Annexin V-FITC流式細(xì)胞術(shù)檢測JQ1對CSC1589細(xì)胞凋亡的影響48-50
• 3.2.2Hochest染色檢測JQ1對CSC1589細(xì)胞凋亡的影響50
• 3.3 JQ1對于CSC1589細(xì)胞周期的影響50-51
• 3.4 JQ1對于CSC1589細(xì)胞干細(xì)胞活性的影響51-52
• 3.5 JQ1對CSC1589細(xì)胞c-Myc基因、凋亡和周期相關(guān)基因m RNA表達(dá)水平的影響52-53
• 3.6 JQ1對CSC1589細(xì)胞C-Myc基因和凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平的影響53-55
• 第四章 討論55-59
• 第五章 結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 致謝64

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本文編號：866472