本文關(guān)鍵詞：綠色熒光蛋白標(biāo)記白血病K562細(xì)胞耐藥性的誘導(dǎo)及其生物學(xué)特性研究

  更多相關(guān)文章： 白血病 綠色熒光蛋白 多藥耐藥 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 凋亡相關(guān)基因 三氧化二砷 白藜蘆醇 細(xì)胞凋亡

【摘要】：目的：以轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立綠色熒光蛋白(GFP)基因標(biāo)記白血病K562細(xì)胞,建立熒光白血病細(xì)胞模型,并在體外采用逐步提高抗腫瘤藥物阿霉素濃度、長(zhǎng)期誘導(dǎo)的方法誘導(dǎo)建立GFP標(biāo)記的熒光白血病多藥耐藥細(xì)胞模型,據(jù)此建立便捷、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)、可動(dòng)態(tài)觀察的抗腫瘤藥物篩選的研究平臺(tái),探討其在抗白血病藥物和耐藥干預(yù)藥物篩選中的應(yīng)用價(jià)值。方法：1.構(gòu)建GFP表達(dá)質(zhì)粒重組質(zhì)粒pCI-neo-GFP,轉(zhuǎn)入白血病K562細(xì)胞,篩選出穩(wěn)定表達(dá)GFP的K562-GFP細(xì)胞株,模擬臨床化療過(guò)程、從0.01mg/L阿霉素開(kāi)始采用逐步提高濃度、長(zhǎng)期、間歇刺激的方法誘導(dǎo)K562-GFP細(xì)胞,直至其能夠耐受8 mg／L阿霉素,獲得具有穩(wěn)定多藥耐藥特性的K562-GFP/ADM細(xì)胞。2.采用MTT比色法動(dòng)態(tài)觀察K562-GFP及K562-GFP/ADM細(xì)胞的增殖活性及對(duì)長(zhǎng)春新堿、三氧化二砷、阿霉素、柔紅霉素、5。氟尿嘧啶、紫杉醇、吡柔比星、依托泊苷等的敏感性；光鏡和電子顯微鏡分別觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,甲基纖維素半固體培養(yǎng)法測(cè)定細(xì)胞集落形成能力。采用RT-PCR法和Western blot法檢測(cè)耐藥相關(guān)基因]mdrl/P-gp、mrp1、MRP1、bcrp/BCRP的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布、P-gp表達(dá)陽(yáng)性率和白血病干細(xì)胞含量。3.以K562-GFP和K562-GFP/ADM細(xì)胞為細(xì)胞模型,研究白藜蘆醇與三氧化二砷的聯(lián)合抗耐藥性白血病作用。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制,AnnexinV/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡；流式細(xì)胞術(shù)、定量RT-PCR和Western blot法測(cè)定凋亡及耐藥相關(guān)基因NF-κB、Bcl-2、Bzx、P53、caspase-3、mdrl、bcrp和mrpl等的表達(dá)。結(jié)果：1.GFP基因轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞,經(jīng)篩選建立的K562-GFP細(xì)胞能穩(wěn)定表達(dá)GFP,表達(dá)率達(dá)95%以上,且細(xì)胞熒光強(qiáng)度高。K562-GFP細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和增殖特性與K562細(xì)胞無(wú)明顯差異。2.采用逐步提高阿霉素藥物濃度、間斷誘導(dǎo)的方法,歷時(shí)14個(gè)月成功誘導(dǎo)了能耐受8.0mg/L阿霉素的K562-GFP/ADM多藥耐藥株。K562-GFP/ADM細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐受性為親本K562-GFP細(xì)胞的115.81倍,且與長(zhǎng)春新堿、柔紅霉素、吡柔比星、5-氟尿嘧啶、依托泊苷和紫杉醇等化療藥物交叉耐藥,但其對(duì)三氧化二砷無(wú)耐受性。經(jīng)阿霉素長(zhǎng)期誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性后,K562-GFP/ADM細(xì)胞體積較小、核/質(zhì)比較大,細(xì)胞周期分布中G0/G1期細(xì)胞增高而S期細(xì)胞降低,但撤除藥物約60天時(shí),細(xì)胞周期分布恢復(fù)接近K562-GFP細(xì)胞水平。與親本K562-GFP細(xì)胞相比,K562-GFP/ADM細(xì)胞具有較強(qiáng)的集落形成能力,細(xì)胞群體中LSC含量約為K562-GFP細(xì)胞的210倍。阿霉素誘導(dǎo)過(guò)程中,K562-GFP細(xì)胞耐藥相關(guān)基因mdr1、mrpl和bcrp的表達(dá)水平逐漸增高,當(dāng)細(xì)胞能夠耐受濃度8 mg/LADM時(shí),mdrl、mrpl和bcrp基因的表達(dá)量分別增高132.5倍、2.85倍和8.87倍。K562-GFP/ADM細(xì)胞P-gp陽(yáng)性率接近100%,撤除藥物后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞P-gp陽(yáng)性率穩(wěn)定不變。3. K562-GFP/ADM細(xì)胞與親本K562-GFP細(xì)胞均對(duì)三氧化二砷敏感,白藜蘆醇可提高三氧化二砷的敏感性。20 μmol/L和40 μmol/L白藜蘆醇分別與2 μmol/L三氧化二砷聯(lián)合作用24-72h,結(jié)果顯示白藜蘆醇顯著增強(qiáng)三氧化二砷對(duì)K562-GFP/ADM細(xì)胞和K562-GFP細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用,尤以K562-GFP/ADM細(xì)胞為甚。2 μmol/L三氧化二砷誘導(dǎo)K562-GFP和K562-GFP/ADM細(xì)胞的凋亡率分別為51.88%和54.88%,而2 μmol/L三氧化二砷與40 μmol/L白藜蘆醇聯(lián)合則分別為77.64%和99.36%。2 μmol/L 三氧化二砷與40 μmol/L白藜蘆醇聯(lián)合顯著降低K562-GFP/ADM細(xì)胞耐藥基因Jndrl/P-gp mrpl/MRP1和bcrp/BCRP以及凋亡抑制基因bcl-2、NF-κB和P53基因的表達(dá),增強(qiáng)bax表達(dá)和caspase-3的活化。結(jié)論：1成功建立了表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的K562-GFP細(xì)胞,并應(yīng)用阿霉素誘導(dǎo)其建立了具有典型多藥耐藥特性的K562-GFP/ADM耐藥細(xì)胞株,可應(yīng)用于抗白血病藥物和耐藥干預(yù)藥物的篩選。2白藜蘆醇顯著增強(qiáng)三氧化二砷對(duì)K562-GFP/ADM耐藥細(xì)胞的增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用,其作用機(jī)制與其降低耐藥細(xì)胞耐藥基因及凋亡抑制基因表達(dá)、增強(qiáng)凋亡基因的表達(dá)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：白血病 綠色熒光蛋白 多藥耐藥 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 凋亡相關(guān)基因 三氧化二砷 白藜蘆醇 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R733.7
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 第一章 白血病多藥耐藥機(jī)制及干預(yù)對(duì)策研究現(xiàn)狀11-39
• 1 前言11
• 2 白血病多藥耐藥相關(guān)機(jī)制11-20
• 3 白血病干細(xì)胞與多藥耐藥20-23
• 4 白血病多藥耐藥的干預(yù)23-26
• 5 三氧化二砷與白血病治療26-30
• 參考文獻(xiàn)30-39
• 第二章 綠色熒光蛋白標(biāo)記白血病K562細(xì)胞的建立39-48
• 1 前言39
• 2 材料和方法39-42
• 2.1 儀器與試劑39-40
• 2.2 方法40-42
• 3 結(jié)果42-44
• 3.1 K562-GFP細(xì)胞與K562細(xì)胞的增殖活性比較42
• 3.2 倒置熒光顯微鏡下K562-GFP細(xì)胞的形態(tài)和GFP熒光42-43
• 3.3 K562-GFP細(xì)胞GFP的表達(dá)和GFP標(biāo)記率43-44
• 4 討論44-45
• 小結(jié)45-46
• 參考文獻(xiàn)46-48
• 第三章 GFP標(biāo)記白血病K562細(xì)胞耐藥性的誘導(dǎo)48-71
• 1 前言48
• 2 材料與方法48-56
• 2.1 儀器與試劑48-51
• 2.2 方法51-56
• 3 結(jié)果56-67
• 3.1 白血病K562-GFP細(xì)胞的耐藥性及交叉耐藥性56-58
• 3.2 K562-GFP/ADM細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化58-60
• 3.3 K562-GFP/ADM細(xì)胞的細(xì)胞周期分布60-62
• 3.4 K562-GFP細(xì)胞耐藥相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)62-64
• 3.5 K562-GFP/ADM細(xì)胞群體中LSC含量的變化64-65
• 3.6 K562-GFP/ADM細(xì)胞的集落形成能力65-67
• 4 討論67-69
• 小結(jié)69-70
• 參考文獻(xiàn)70-71
• 第四章 白藜蘆醇與三氧化二砷聯(lián)合誘導(dǎo)耐藥性白血病K562-GFP/ADM細(xì)胞凋亡71-102
• 1 前言71
• 2 材料與方法71-77
• 2.1 儀器與試劑71-73
• 2.2 方法73-77
• 3 結(jié)果77-97
• 3.1 As_2O_3對(duì)K562-GFP/ADM細(xì)胞的增殖抑制作用77
• 3.2 Rsv對(duì)K562-GFP/ADM細(xì)胞的增殖抑制作用77-78
• 3.3 Rsv增強(qiáng)As_2O_3對(duì)K562-GFP/ADM細(xì)胞的增殖抑制作用78-80
• 3.4 Rsv增強(qiáng)As_2O_3對(duì)K562-GFP/ADM細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用80-97
• 4 討論97-99
• 小結(jié)99-100
• 參考文獻(xiàn)100-102
• 結(jié)論102-103
• 縮略詞表103-106
• 攻讀學(xué)位期間完成的科研成果106-107
• 致謝107

【引證文獻(xiàn)】

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 支蕾;張軼群;于凡;邢海燕;唐克晶;田征;饒青;王敏;王建祥;;N-cadherin和Tie2在CD34+/CD38-/CD123+白血病干細(xì)胞的表達(dá)及其作為白血病干細(xì)胞標(biāo)志的初步研究[A];第12屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要[C];2009年

2 黃明;孟凡義;;Bortezomib或聯(lián)合三氧化二砷逆轉(zhuǎn)HL60/ADM細(xì)胞耐藥及其機(jī)制的研究[A];第12屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要[C];2009年

3 蔡寶;劉岸;魏為添;林勝璋;;三氧化二砷和吉西他濱在抗胰腺癌裸鼠移植瘤體內(nèi)生長(zhǎng)中的協(xié)同作用[A];2009年浙江省外科學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2009年

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本文編號(hào)：861428