本文關(guān)鍵詞：共刺激分子B7-H3在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)的臨床意義及其作用機(jī)制

  更多相關(guān)文章： 腦膠質(zhì)瘤 B7-H3 c-met 惡性胸水 單克隆抗體

【摘要】：B7-H3是共刺激分子B7家族的重要成員,近年來關(guān)于其在腫瘤細(xì)胞上的異常表達(dá)以及在腫瘤微環(huán)境中介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的研究引起了廣泛的關(guān)注。B7-H3蛋白在人體正常組織不表達(dá),在肺癌、尿路移形細(xì)胞癌、腎癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤以及前列腺癌等多種腫瘤組織中高表達(dá),被認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為直接相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),在乳腺癌、黑色素瘤和卵巢癌等腫瘤細(xì)胞株中抑制B7-H3的表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲能力的下降,推測B7-H3可以調(diào)控腫瘤本身的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。而在肝癌中,B7-H3的過表達(dá)顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、粘附遷移能力。此外,一株針對B7-H3的單克隆抗體8H9已經(jīng)用于治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤的臨床一期檢測中。盡管如此,B7-H3調(diào)控腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的作用機(jī)制尚未明確。腦膠質(zhì)瘤是中樞腦系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,約占人顱內(nèi)腫瘤的45%-60%。病人術(shù)后生存率低,易復(fù)發(fā),放化療效果差,這些都與腦膠質(zhì)侵襲性生長的特性密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞的侵襲受到多種表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面的受體分子和腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子調(diào)控。最近的研究發(fā)現(xiàn),B7-H3在腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞株中高表達(dá),且B7-H3的基因沉默減弱了腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的侵襲性,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn),B7-H3基因表達(dá)的降低會(huì)明顯減少腫瘤細(xì)胞對周邊組織的侵襲,從而表明B7-H3可能成為治療腦膠質(zhì)瘤的靶向分子。但由于受體未知,其具體的作用機(jī)制尚未清晰,所以,探索B7-H3的未知受體或者與之相作用的分子是B7-H3功能研究過程中亟需解決的問題。鑒此,本研究將以腦膠質(zhì)瘤為研究對象,分析B7-H3在腫瘤組織中的表達(dá)與臨床意義,觀察B7-H3對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,并進(jìn)一步探索與B7-H3相互作用的分子及其調(diào)控機(jī)制,為臨床診斷和治療惡性腫瘤提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外,本研究前期工作通過用表達(dá)B7-H3的惡性胸水細(xì)胞免疫小鼠獲得抗體,從中選取一株表達(dá)最高的單克隆抗體,通過免疫共沉淀和質(zhì)譜測序的方法進(jìn)行驗(yàn)證,鑒定結(jié)果為特異識(shí)別B7-H3單克隆抗體。這也為我們進(jìn)一步研究B7-H3的生物學(xué)功能提供了有力的物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)手段。本論文分為兩部分:一、共刺激分子B7-H3在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)的臨床意義及其作用機(jī)制【目的】:分析B7-H3在腦膠質(zhì)瘤中組織中的表達(dá)及意義,探討在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞上表達(dá)的與B7-H3相互作用的分子及可能機(jī)制�！痉椒ā�:采用免疫組化檢測腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本的B7-H3和c-met的表達(dá);Real-time PCR方法檢測腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本、細(xì)胞株的B7-H3和c-met m RNA的表達(dá);采用si-RNA干擾的方法下調(diào)U87的B7-H3的表達(dá);通過侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力;采用CBA試劑盒通過流式的方法檢測細(xì)胞因子的分泌;采用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)探索B7-H3影響侵襲的信號(hào)通路相關(guān)分子的變化;采用基因轉(zhuǎn)染的技術(shù)建立過表達(dá)B7-H3-HA的U87細(xì)胞株;通過免疫共沉淀的方法鑒定與B7-H3相互作用的分子;免疫熒光技術(shù)和共聚焦顯微鏡檢測B7-H3和c-met在U87細(xì)胞上共表達(dá)現(xiàn)象。【結(jié)果】:(1)免疫組化和real-time PCR結(jié)果顯示,腦膠質(zhì)瘤組織(200例)的B7-H3的表達(dá)與腫瘤的病理分級相關(guān),并與病人生存率呈負(fù)相關(guān);(2)抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87上B7-H3的表達(dá)下調(diào)了細(xì)胞的侵襲能力,并且引起MMP2(基質(zhì)金屬蛋白酶2)表達(dá)以及IL-6和IL-8分泌的下降;(3)相關(guān)信號(hào)分子AKT,STAT3和JAK2的磷酸化水平都呈不同程度的下調(diào);(4)通過免疫共沉淀的方法發(fā)現(xiàn)與B7-H3相互作用的分子為c-met(肝細(xì)胞生長因子受體),而B7-H3的下調(diào)可引起原癌基因c-met磷酸化水平的下降。進(jìn)而共聚焦和免疫組化檢測顯示,B7-H3與c-met在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株和腫瘤組織中呈共表達(dá)。臨床標(biāo)本分析也發(fā)現(xiàn)B7-H3與c-met的m RNA和蛋白水平在組織標(biāo)本中呈正相關(guān)�！窘Y(jié)論】:腦膠質(zhì)瘤中B7-H3的表達(dá)與病理分級以及病人術(shù)后生存率相關(guān),抑制B7-H3分子的表達(dá)下調(diào)了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力,這有可能是通過抑制了腫瘤細(xì)胞中MMP2的表達(dá)以及IL-6和IL-8的分泌,并且涉及到AKT/STAT3/JAK2等信號(hào)通路。本研究首次證實(shí),B7-H3可與c-met相互作用,并在腫瘤細(xì)胞和組織上共表達(dá),提示B7-H3對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的作用可能通過與c-met途徑介導(dǎo)。這為進(jìn)一步研究B7-H3的生物學(xué)功能和腦膠質(zhì)瘤新的診斷和治療方法提供了原創(chuàng)性的理論依據(jù)。二、鼠抗人B7-H3單克隆抗體的制備和生物學(xué)功能的鑒定【目的】:通過表達(dá)B7-H3的惡性胸水免疫細(xì)胞免疫BALB/c小鼠獲得特異性單克隆抗體,用抗體識(shí)別抗原的方法進(jìn)行免疫共沉淀,并通過質(zhì)譜測序的方法鑒定對應(yīng)的抗原,并初步研究其生物學(xué)功能�！痉椒ā�:用表達(dá)B7-H3的惡性胸水免疫細(xì)胞作為免疫原免疫BALB/c小鼠,用本試驗(yàn)的骨髓瘤細(xì)胞(AG8)和小鼠脾臟細(xì)胞融合方法選擇性培養(yǎng),用PBMC作為陰性篩選細(xì)胞株,用胸水免疫細(xì)胞為陽性篩選細(xì)胞株,通過流式細(xì)胞術(shù)對雜交瘤進(jìn)行篩選。后通過抗原抗體結(jié)合的方法,用免疫功共沉淀和質(zhì)譜測序的技術(shù)方法鑒定抗原分子。純化單克隆抗體,并對其生物學(xué)功能進(jìn)行初步研究�！窘Y(jié)果】:成功獲得78株特異性分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,并以其中一株篩選表達(dá)最高的作為我們的研究對象,命名為Y4F11,因其與胸水免疫細(xì)胞和U937的結(jié)合最高,用銀染和質(zhì)譜測序的方法檢測到細(xì)胞經(jīng)過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)后結(jié)合的抗原分子均為B7-H3。【結(jié)論】:成功鑒定Y4F11所對應(yīng)的抗原分子為B7-H3,為我們進(jìn)一步研究B7-H3及其生物學(xué)功能提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。同時(shí)建立一種抗體鑒定抗原的方法和實(shí)驗(yàn)體系,為我們繼續(xù)發(fā)現(xiàn)更多的細(xì)胞表面活化分子和研究它們的生物學(xué)功能提供了有價(jià)值的技術(shù)手段。
【關(guān)鍵詞】：腦膠質(zhì)瘤 B7-H3 c-met 惡性胸水 單克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abatract7-12
• 研究背景12-26
• 1 B7-H3的結(jié)構(gòu)和表達(dá)譜12-16
• 2 B7-H3的生物學(xué)功能16-19
• 3 B7-H3與腦膠質(zhì)瘤19-20
• 4 總結(jié)20-21
• 參考文獻(xiàn)21-26
• 第一部分 共刺激分子B7-H3在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)的臨床意義及其作用機(jī)制26-45
• 材料與方法27-31
• 結(jié)果31-40
• 討論40-42
• 參考文獻(xiàn)42-45
• 第二部分 鼠抗人B7-H3單克隆抗體的制備和生物學(xué)功能的鑒定45-62
• 材料與方法45-53
• 結(jié)果53-60
• 討論60
• 參考文獻(xiàn)60-62
• 總結(jié)與展望62-63
• 展望62-63
• 碩士學(xué)位學(xué)習(xí)期間發(fā)表的論文63-64
• 本課題的受資助情況64-65
• 縮寫詞表65-67
• 致謝67-69

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