本文關(guān)鍵詞：共刺激分子B7-H3在人腦膠質(zhì)瘤細胞表達的臨床意義及其作用機制

  更多相關(guān)文章： 腦膠質(zhì)瘤 B7-H3 c-met 惡性胸水 單克隆抗體

【摘要】：B7-H3是共刺激分子B7家族的重要成員,近年來關(guān)于其在腫瘤細胞上的異常表達以及在腫瘤微環(huán)境中介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的研究引起了廣泛的關(guān)注。B7-H3蛋白在人體正常組織不表達,在肺癌、尿路移形細胞癌、腎癌、神經(jīng)母細胞瘤以及前列腺癌等多種腫瘤組織中高表達,被認(rèn)為與腫瘤細胞生物學(xué)行為直接相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),在乳腺癌、黑色素瘤和卵巢癌等腫瘤細胞株中抑制B7-H3的表達導(dǎo)致腫瘤細胞的黏附、遷移和侵襲能力的下降,推測B7-H3可以調(diào)控腫瘤本身的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。而在肝癌中,B7-H3的過表達顯著增強腫瘤細胞的增殖、侵襲、粘附遷移能力。此外,一株針對B7-H3的單克隆抗體8H9已經(jīng)用于治療神經(jīng)母細胞瘤的臨床一期檢測中。盡管如此,B7-H3調(diào)控腫瘤細胞生物學(xué)行為的作用機制尚未明確。腦膠質(zhì)瘤是中樞腦系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,約占人顱內(nèi)腫瘤的45%-60%。病人術(shù)后生存率低,易復(fù)發(fā),放化療效果差,這些都與腦膠質(zhì)侵襲性生長的特性密切相關(guān)。腫瘤細胞的侵襲受到多種表達在腫瘤細胞表面的受體分子和腫瘤微環(huán)境中的細胞因子調(diào)控。最近的研究發(fā)現(xiàn),B7-H3在腦膠質(zhì)瘤組織和細胞株中高表達,且B7-H3的基因沉默減弱了腦膠質(zhì)瘤細胞株的侵襲性,在動物實驗中也發(fā)現(xiàn),B7-H3基因表達的降低會明顯減少腫瘤細胞對周邊組織的侵襲,從而表明B7-H3可能成為治療腦膠質(zhì)瘤的靶向分子。但由于受體未知,其具體的作用機制尚未清晰,所以,探索B7-H3的未知受體或者與之相作用的分子是B7-H3功能研究過程中亟需解決的問題。鑒此,本研究將以腦膠質(zhì)瘤為研究對象,分析B7-H3在腫瘤組織中的表達與臨床意義,觀察B7-H3對腫瘤細胞生物學(xué)行為的影響,并進一步探索與B7-H3相互作用的分子及其調(diào)控機制,為臨床診斷和治療惡性腫瘤提供新的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。此外,本研究前期工作通過用表達B7-H3的惡性胸水細胞免疫小鼠獲得抗體,從中選取一株表達最高的單克隆抗體,通過免疫共沉淀和質(zhì)譜測序的方法進行驗證,鑒定結(jié)果為特異識別B7-H3單克隆抗體。這也為我們進一步研究B7-H3的生物學(xué)功能提供了有力的物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)手段。本論文分為兩部分:一、共刺激分子B7-H3在人腦膠質(zhì)瘤細胞表達的臨床意義及其作用機制【目的】:分析B7-H3在腦膠質(zhì)瘤中組織中的表達及意義,探討在腦膠質(zhì)瘤細胞上表達的與B7-H3相互作用的分子及可能機制�！痉椒ā�:采用免疫組化檢測腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本的B7-H3和c-met的表達;Real-time PCR方法檢測腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本、細胞株的B7-H3和c-met m RNA的表達;采用si-RNA干擾的方法下調(diào)U87的B7-H3的表達;通過侵襲實驗檢測細胞的侵襲能力;采用CBA試劑盒通過流式的方法檢測細胞因子的分泌;采用蛋白印跡實驗探索B7-H3影響侵襲的信號通路相關(guān)分子的變化;采用基因轉(zhuǎn)染的技術(shù)建立過表達B7-H3-HA的U87細胞株;通過免疫共沉淀的方法鑒定與B7-H3相互作用的分子;免疫熒光技術(shù)和共聚焦顯微鏡檢測B7-H3和c-met在U87細胞上共表達現(xiàn)象。【結(jié)果】:(1)免疫組化和real-time PCR結(jié)果顯示,腦膠質(zhì)瘤組織(200例)的B7-H3的表達與腫瘤的病理分級相關(guān),并與病人生存率呈負(fù)相關(guān);(2)抑制腦膠質(zhì)瘤細胞株U87上B7-H3的表達下調(diào)了細胞的侵襲能力,并且引起MMP2(基質(zhì)金屬蛋白酶2)表達以及IL-6和IL-8分泌的下降;(3)相關(guān)信號分子AKT,STAT3和JAK2的磷酸化水平都呈不同程度的下調(diào);(4)通過免疫共沉淀的方法發(fā)現(xiàn)與B7-H3相互作用的分子為c-met(肝細胞生長因子受體),而B7-H3的下調(diào)可引起原癌基因c-met磷酸化水平的下降。進而共聚焦和免疫組化檢測顯示,B7-H3與c-met在腦膠質(zhì)瘤細胞株和腫瘤組織中呈共表達。臨床標(biāo)本分析也發(fā)現(xiàn)B7-H3與c-met的m RNA和蛋白水平在組織標(biāo)本中呈正相關(guān)。【結(jié)論】:腦膠質(zhì)瘤中B7-H3的表達與病理分級以及病人術(shù)后生存率相關(guān),抑制B7-H3分子的表達下調(diào)了腫瘤細胞的侵襲能力,這有可能是通過抑制了腫瘤細胞中MMP2的表達以及IL-6和IL-8的分泌,并且涉及到AKT/STAT3/JAK2等信號通路。本研究首次證實,B7-H3可與c-met相互作用,并在腫瘤細胞和組織上共表達,提示B7-H3對腦膠質(zhì)瘤細胞侵襲的作用可能通過與c-met途徑介導(dǎo)。這為進一步研究B7-H3的生物學(xué)功能和腦膠質(zhì)瘤新的診斷和治療方法提供了原創(chuàng)性的理論依據(jù)。二、鼠抗人B7-H3單克隆抗體的制備和生物學(xué)功能的鑒定【目的】:通過表達B7-H3的惡性胸水免疫細胞免疫BALB/c小鼠獲得特異性單克隆抗體,用抗體識別抗原的方法進行免疫共沉淀,并通過質(zhì)譜測序的方法鑒定對應(yīng)的抗原,并初步研究其生物學(xué)功能�！痉椒ā�:用表達B7-H3的惡性胸水免疫細胞作為免疫原免疫BALB/c小鼠,用本試驗的骨髓瘤細胞(AG8)和小鼠脾臟細胞融合方法選擇性培養(yǎng),用PBMC作為陰性篩選細胞株,用胸水免疫細胞為陽性篩選細胞株,通過流式細胞術(shù)對雜交瘤進行篩選。后通過抗原抗體結(jié)合的方法,用免疫功共沉淀和質(zhì)譜測序的技術(shù)方法鑒定抗原分子。純化單克隆抗體,并對其生物學(xué)功能進行初步研究。【結(jié)果】:成功獲得78株特異性分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株,并以其中一株篩選表達最高的作為我們的研究對象,命名為Y4F11,因其與胸水免疫細胞和U937的結(jié)合最高,用銀染和質(zhì)譜測序的方法檢測到細胞經(jīng)過免疫共沉淀實驗后結(jié)合的抗原分子均為B7-H3。【結(jié)論】:成功鑒定Y4F11所對應(yīng)的抗原分子為B7-H3,為我們進一步研究B7-H3及其生物學(xué)功能提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。同時建立一種抗體鑒定抗原的方法和實驗體系,為我們繼續(xù)發(fā)現(xiàn)更多的細胞表面活化分子和研究它們的生物學(xué)功能提供了有價值的技術(shù)手段。
【關(guān)鍵詞】：腦膠質(zhì)瘤 B7-H3 c-met 惡性胸水 單克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abatract7-12
• 研究背景12-26
• 1 B7-H3的結(jié)構(gòu)和表達譜12-16
• 2 B7-H3的生物學(xué)功能16-19
• 3 B7-H3與腦膠質(zhì)瘤19-20
• 4 總結(jié)20-21
• 參考文獻21-26
• 第一部分 共刺激分子B7-H3在人腦膠質(zhì)瘤細胞表達的臨床意義及其作用機制26-45
• 材料與方法27-31
• 結(jié)果31-40
• 討論40-42
• 參考文獻42-45
• 第二部分 鼠抗人B7-H3單克隆抗體的制備和生物學(xué)功能的鑒定45-62
• 材料與方法45-53
• 結(jié)果53-60
• 討論60
• 參考文獻60-62
• 總結(jié)與展望62-63
• 展望62-63
• 碩士學(xué)位學(xué)習(xí)期間發(fā)表的論文63-64
• 本課題的受資助情況64-65
• 縮寫詞表65-67
• 致謝67-69

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