本文關鍵詞：AC1MMYR2抑制癌相關成纖維細胞誘導腫瘤轉(zhuǎn)移和化療耐藥的研究

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【摘要】：目的乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤,轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因。乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移潛力密切依賴于腫瘤微環(huán)境,腫瘤微環(huán)境是由癌細胞、免疫細胞、癌相關成纖維細胞、細胞外基質(zhì)等組成。其中癌相關成纖維細胞(CAFs)是腫瘤微環(huán)境中的組成成分之一,在促進腫瘤轉(zhuǎn)移和誘導化療耐藥中發(fā)揮重要作用。此外,我們實驗室之前的研究結(jié)果表明,miR-21在CAFs中過量表達,揭示miR-21異常表達可能與CAFs的形成與功能發(fā)揮密切相關。本論文主要探討miR-21及miR-21小分子抑制劑——AC1MMYR2(AMR)在CAFs誘導的腫瘤轉(zhuǎn)移和紫杉醇化療耐藥過程中的作用及分子機制。方法1、利用原位雜交和免疫組化檢測60對浸潤性乳腺原位癌及轉(zhuǎn)移癌中miR-21,FAP-α和α-SMA的表達水平,研究此三種蛋白的表達量和腫瘤轉(zhuǎn)移之間的相關性。2、以乳腺癌細胞系MDA-MB-231和MCF-7為模型,在以下幾種條件下培養(yǎng):標準培養(yǎng)基培養(yǎng)、CAFs條件培養(yǎng)基(CAF-CM)、加入AMR處理CAFs細胞24h后的條件培養(yǎng)基(AMR-CAF-CM)、加入紫杉醇、同時加入AMR-CAF-CM和紫杉醇;顯微鏡明場拍照觀察細胞形態(tài)變化;Transwell和Wound Healing Assay檢測細胞侵襲和遷移能力;Western Bloting或免疫熒光檢測β-catenin、Vimentin、NF-κB等蛋白表達水平;Real-time PCR檢測細胞中miR-21表達水平;免疫共沉淀檢測細胞中β-catenin和NF-κB的相互作用關系;MTT法檢測細胞在藥物處理后的細胞半數(shù)致死量(IC50)。3、構建MDA-MB-231裸鼠乳腺癌原位模型。轉(zhuǎn)染luciferase慢病毒的MDA-MB-231和CAFs以1:3注射到裸鼠乳腺脂肪墊上,建立乳腺癌裸鼠原位模型,體內(nèi)研究AMR對CAFs誘導的腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。小鼠被隨機分為六組(每組8只):PBS、taxol、CAFs、CAFs-taxol、AMR-CAFs、AMR-CAFs+taxol。小動物活體成像技術檢測腫瘤大小和肺轉(zhuǎn)移的熒光信號;HE染色鑒定是否發(fā)生肺轉(zhuǎn)移;免疫組化檢測FAP-α,α-SMA,NF-κB,β-catenin和VHL的表達情況;免疫熒光檢測冰凍切片組織中α-SMA和Cytokeratin的蛋白表達水平。結(jié)果第一,主要研究了癌相關成纖維細胞(CAFs)對乳腺癌轉(zhuǎn)移和紫杉醇耐藥性的作用。CAFs的標志性蛋白為FAP-α和α-SMA,本論文中針對60組浸潤性乳腺原位癌及轉(zhuǎn)移癌的病人樣本進行檢測,發(fā)現(xiàn)FAP-α、α-SMA以及miR-21的高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關。進而為后續(xù)實驗提供CAFs和正常組織的成纖維細胞(NFs),我們分離并原代培養(yǎng)CAFs和NFs,發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的CAFs細胞中高表達FAP-α、α-SMA和間質(zhì)標記蛋白Vimentin,而不表達表皮標記蛋白E-cadherin和Cytokeratin,說明本論文中原代培養(yǎng)的CAFs保留了此類細胞的特性,能夠用于后續(xù)實驗。之后,將乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231經(jīng)CAFs條件培養(yǎng)基(CAF-CM)或者NFs細胞條件培養(yǎng)基(NF-CM)培養(yǎng),與NFs組相比,CAFs能夠使乳腺癌細胞伸出微小偽足樣胞質(zhì)突起,形態(tài)上由具有極性的上皮細胞改變?yōu)槔w維狀的間質(zhì)細胞,細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力顯著增強;同時CAF-CM培養(yǎng)的乳腺癌細胞其上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)相關蛋白β-catenin、ZEB1、ZEB2表達水平顯著升高,說明CAFs能夠促進乳腺癌細胞發(fā)生EMT,從而加速轉(zhuǎn)移。最后,MCF-7和MDA-MB-231的紫杉醇的半數(shù)最大抑制濃度(IC50)分別是0.1μM和0.4μM,經(jīng)CFA-CM處理后IC50值增加了8-10倍,說明CAFs提高了乳腺癌細胞對紫杉醇的耐受性。綜合以上結(jié)果說明,在乳腺癌病人樣本中CAFs細胞與癌癥淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關,同時在細胞水平證明了,CAFs能夠誘導乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移和對紫杉醇的化療耐藥。第二,主要研究miR-21在CAFs誘導乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移中的作用。RT-PCR方法證明了,經(jīng)CAF-CM處理,MCF-7和MDA-MB-231的miR-21表達水平分別增加了1.8和2.4倍,證明CAFs能夠誘導癌癥細胞表達miR-21。此外,采用轉(zhuǎn)染miR-21 mimics的NFs培養(yǎng)以上兩種乳腺癌細胞,細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強、細胞形態(tài)由上皮向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變、EMT相關β-catenin和Vimentin的表達水平升高;AMR-CAF-CM處理可降低CAFs中miR-21的表達,并且能夠有效逆轉(zhuǎn)CAFs誘導的乳腺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移,減少β-catenin和Vimentin表達,達到正常成纖維細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)的效果。以上結(jié)果說明,miR-21在CAFs的高表達是其促進乳腺癌細胞EMT以及轉(zhuǎn)移的關鍵因素。第三,主要研究miR-21抑制劑——AMR對CAFs誘導乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移和紫杉醇耐受性的作用及其分子機制。AMR-CAF-CM處理能夠降低CAFs誘導的MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。其次,紫杉醇能夠抑制乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲,但是在CAF-CM處理乳腺癌細胞時,紫杉醇無法對癌細胞轉(zhuǎn)移和侵襲發(fā)揮促進作用。而在AMR-CAF-CM處理乳腺癌細胞時,同時加入紫杉醇,可以下調(diào)β-catenin、ZEB1、ZEB2的表達,上調(diào)E-cadherin的表達,減少β-catenin核轉(zhuǎn)位,即抑制細胞發(fā)生EMT。以上結(jié)果說明,AMR重塑CAFs,抑制CAFs誘導的乳腺癌轉(zhuǎn)移并提高乳腺癌細胞對紫杉醇的敏感性。進一步實驗,對CAFs促進乳腺癌細胞由內(nèi)皮向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變過程的機制進行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn):AMR-CAF-CM處理MCF-7和MDA-MB-231時,能夠抑制miR-21的表達,促進miR-21的靶基因VHL的表達,導致NF-κB表達降低,減少NF-κB和β-catenin的共沉淀,抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移,增強紫杉醇的化療效果。說明AMR可以通過miR-21/VHL/NF-κB抑制CAFs誘導乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移和增強紫杉醇化療效果。第四,在小鼠體內(nèi)驗證AMR的作用。生物發(fā)光成像顯示紫杉醇可以在一定程度上抑制腫瘤的生長,在CAFs處理組紫杉醇藥效降低,而AMR聯(lián)合紫杉醇可以顯著抑制腫瘤生長。此外,HE染色實驗表明CAFs能夠促進癌癥細胞的肺轉(zhuǎn)移,產(chǎn)生廣泛的腫瘤灶,聯(lián)合治療組能夠抑制肺轉(zhuǎn)移。此外免疫組化實驗表明AMR能使CAFs細胞中FAP-α,α-SMA的表達水平顯著降低,使乳腺癌細胞中VHL的表達水平升高,β-catenin、NF-κB的表達水平降低。該體內(nèi)實驗的結(jié)果再次驗證了細胞實驗的結(jié)論。結(jié)論本論文證明了CAFs能夠促進乳腺癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、EMT和對紫杉醇的化療耐藥,并且發(fā)現(xiàn)miR-21是維持CAFs對乳腺癌細胞作用的關鍵因素。采用miR-21的小分子抑制劑——AC1MMYR2能夠抑制CAFs對癌癥細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的促進作用并增強癌細胞對紫杉醇的化療敏感性,其分子機制為AC1MMYR2抑制CAFs細胞中miR-21的表達,重塑CAFs細胞,進而降低乳腺癌細胞中miR-21的表達,并靶向VHL抑制NF-κB信號通路的激活以及NF-κB和β-catenin的相互結(jié)合,從而阻礙癌細胞發(fā)生EMT。該研究為今后AMR用于臨床腫瘤治療奠定了理論及實驗基礎。
【關鍵詞】：AC1MMYR2 癌相關成纖維細胞 NF-κB VHL 轉(zhuǎn)移
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-16
• 縮略語說明16-17
• 前言17-20
• 研究現(xiàn)狀、成果17-18
• 研究目的、方法18-20
• 一、癌相關成纖維細胞對腫瘤細胞的影響20-39
• 1.1 對象和方法20-25
• 1.1.1 細胞系20
• 1.1.2 實驗材料20-25
• 1.2 試驗方法25-31
• 1.2.1 細胞培養(yǎng)25-26
• 1.2.2 原位雜交和免疫組化檢測mi R-21、FAP-α 和 α-SMA的表達26-28
• 1.2.3 Western Bloting檢測CAFs標記蛋白的表達28-29
• 1.2.4 免疫熒光檢測CAFs標記蛋白的表達29-30
• 1.2.5 Transwell和劃痕檢測細胞遷移和侵襲能力30-31
• 1.2.6 MTT法檢測紫杉醇對乳腺癌細胞的增殖的影響31
• 1.2.7 統(tǒng)計學方法31
• 1.3 結(jié)果31-36
• 1.3.1 FAP-α、α-SMA、mi R-21 的表達水平與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關31-32
• 1.3.2 人類乳腺癌的癌相關成纖維細胞的分離32-34
• 1.3.3 CAFs對乳腺癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響34-35
• 1.3.4 CAFs對乳腺癌細胞紫杉醇IC50的影響35-36
• 1.4 討論36-37
• 1.4.1 腫瘤微環(huán)境的主要成分36
• 1.4.2 CAFs的標記性蛋白36
• 1.4.3 CAFs對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響36-37
• 1.4.4 CAFs對腫瘤細胞EMT的影響37
• 1.4.5 CAFs對腫瘤化療敏感性的影響37
• 1.5 小結(jié)37-39
• 二、AC1MMYR2抑制癌相關成纖維細胞誘導腫瘤轉(zhuǎn)移和化療耐藥分子機制的研究39-61
• 2.1 研究對象和方法39-41
• 2.1.1 細胞系39
• 2.1.2 實驗材料39-41
• 2.2 實驗方法41-46
• 2.2.1 Real-time PCR檢測mi R-21 和NF-κB表達水平的影響41-44
• 2.2.2 免疫熒光檢測NF-κB的亞細胞定位44
• 2.2.3 免疫熒光和Western Blot檢測NF-κB通路中相關蛋白的表達水平44
• 2.2.4 免疫共沉淀檢測NF-κB和 β-catenin之間的相互作用44-45
• 2.2.5 免疫熒光和Western Blot檢測AMR處理CAFs相關蛋白的表達情況45
• 2.2.6 免疫熒光檢測EMT相關蛋白的表達情況及亞細胞定位45
• 2.2.7 Western Bloting檢測敲除和過表達VHL后EMT相關蛋白的表達水平45-46
• 2.2.8 統(tǒng)計學方法46
• 2.3 結(jié)果46-58
• 2.3.1 AMR對CAFs誘導乳腺癌中miR-21 表達的影響46-47
• 2.3.2 miR-21 對CAFs誘導腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、侵襲和EMT中的影響47-49
• 2.3.3 AMR對CAFs的影響49-50
• 2.3.4 AMR對CAFs誘導腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和EMT的作用50-53
• 2.3.5 AMR對CAFs誘導乳腺癌細胞中的NF-κB信號通路的影響53-55
• 2.3.6 AMR對 β-catenin和NF-κB之間相互作用的影響55-56
• 2.3.7 AMR通過調(diào)控VHL抑制CAFs誘導EMT的作用56-58
• 2.4 討論58-60
• 2.4.1 CAFs的來源和功能發(fā)揮58
• 2.4.2 CAFs中mi RNA的異常表達58-59
• 2.4.3 CAFs對NF-κB的活性的影響59
• 2.4.4 miRNAs對CAFs的影響59-60
• 2.5 小結(jié)60-61
• 三、AC1MMYR2抑制癌相關成纖維細胞誘導腫瘤轉(zhuǎn)移的體內(nèi)研究61-70
• 3.1 實驗材料61-62
• 3.1.1 細胞系及重組慢病毒載體61
• 3.1.2 實驗動物61
• 3.1.3 實驗藥品與試劑61-62
• 3.1.4 實驗儀器和材料62
• 3.2 實驗方法62-63
• 3.2.1 重組慢病毒的轉(zhuǎn)染62
• 3.2.2 乳腺癌原位腫瘤模型62-63
• 3.2.3 H＆E染色63
• 3.2.4 免疫組化檢測NF-κB、β-catenin、VHL、α-SMA和FAP-α 的表達水平63
• 3.2.5 統(tǒng)計學處理63
• 3.3 結(jié)果63-67
• 3.3.1 腫瘤治療的效果63-64
• 3.3.2 肺轉(zhuǎn)移情況64-65
• 3.3.3 H＆E 染色、免疫組化和免疫熒光結(jié)果65-67
• 3.3.4 AC1MMYR2逆轉(zhuǎn)癌相關成纖維細胞誘導腫瘤轉(zhuǎn)移的機制67
• 3.4 討論67-69
• 3.5 小結(jié)69-70
• 結(jié)論70-71
• 參考文獻71-82
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明82-83
• 綜述 RNAs在調(diào)控癌相關成纖維細胞中的作用83-100
• 綜述參考文獻89-100
• 致謝100-101
• 個人簡歷101

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本文編號：854383