本文關(guān)鍵詞：共刺激分子B7-H3對(duì)食管癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及作用機(jī)制的研究

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【摘要】：惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康,其中以食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、肝癌等為代表的消化系統(tǒng)腫瘤對(duì)患者的威脅最大。深入了解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制,發(fā)現(xiàn)新的腫瘤治療靶點(diǎn)意義重大。腫瘤的免疫療法是繼手術(shù)、放療、化療之后腫瘤治療的新方向。B7-H3(CD276),一種免疫球蛋白,是B7共刺激分子家族的新成員。B7-H3在多種腫瘤組織中高表達(dá),并與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān),是腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)。本課題小組始終致力于B7共刺激分子家族在腫瘤中表達(dá)意義的研究,前期研究發(fā)現(xiàn),共刺激分子B7-H3在人食管癌組織中高表達(dá),其表達(dá)與患者腫瘤浸潤(rùn)深度正相關(guān),與CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量成負(fù)相關(guān)。體外敲低食管癌細(xì)胞B7-H3的表達(dá)可以抑制佛波酯(PMA)誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化。這些研究結(jié)果提示,B7-H3可能參與了食管癌的腫瘤進(jìn)展。在本研究中,首先檢測(cè)了人食管癌細(xì)胞株KYSE-170、Eca-109、TE-13、TE-1、Eca-9706和人正常食管上皮細(xì)胞(HEEC)中B7-H3的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)B7-H3在食管癌細(xì)胞表達(dá)明顯增高。通過基因轉(zhuǎn)染敲低B7-H3的表達(dá)研究其對(duì)食管癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。通過Agilent表達(dá)譜基因芯片,篩選與B7-H3表達(dá)相關(guān)的基因,探討B(tài)7-H3參與食管癌腫瘤進(jìn)展可能的作用機(jī)制。第一部分共刺激分子B7-H3對(duì)食管癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響目的:研究敲低B7-H3的表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。方法:1應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time quantitative PCR,q RT-PCR)和Western Blot法檢測(cè)人食管癌細(xì)胞株KYSE-170、Eca-109、TE-13、TE-1、Eca-9706和人正常食管上皮細(xì)胞HEEC中B7-H3 m RNA和蛋白的表達(dá)情況。2應(yīng)用轉(zhuǎn)染Hu SH 29mer sh RNA的方法構(gòu)建B7-H3穩(wěn)定低表達(dá)的食管癌細(xì)胞株Eca-109,并通過Real time PCR、Western Blot法、熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞分析技術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測(cè)轉(zhuǎn)染率和對(duì)基因的沉默效率。3應(yīng)用MTS實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn),檢測(cè)下調(diào)B7-H3表達(dá)后對(duì)Eca-109細(xì)胞增殖能力的影響。4應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn),檢測(cè)下調(diào)B7-H3表達(dá)后對(duì)Eca-109細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。5應(yīng)用流式細(xì)胞分析技術(shù),檢測(cè)下調(diào)B7-H3表達(dá)后對(duì)Eca-109細(xì)胞細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。6應(yīng)用血管生成實(shí)驗(yàn),檢測(cè)下調(diào)Eca-109細(xì)胞B7-H3表達(dá)后其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成能力的影響。7應(yīng)用裸鼠皮下移植瘤模型觀察下調(diào)B7-H3表達(dá)后對(duì)Eca-109細(xì)胞體內(nèi)增殖的影響。結(jié)果:1實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果顯示,不同食管癌細(xì)胞株B7-H3 m RNA表達(dá)水平KYSE-170(1.000±0.000)、Eca-109(3.210±0.609)、TE-13(1.919±0.067)、TE-1(1.399±0.136)、Eca-9706(1.447±0.319)均高于人正常食管上皮細(xì)胞HEEC(0.151±0.057),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western Blot與Real time PCR法分析結(jié)果相一致。因?yàn)锽7-H3在Eca-109細(xì)胞中表達(dá)最高,故選用Eca-109進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2成功構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染B7-H3沉默質(zhì)粒sh RNA p-GFP-V-RS和對(duì)照無效質(zhì)粒p-GFP-V-RS TR30007(TR37)的Eca-109細(xì)胞,并分別命名為Eca-109 sh B7-H3和Eca-109 TR37。熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,基因轉(zhuǎn)染率可達(dá)90%以上。Real-Time PCR法分析結(jié)果顯示,與Eca-109細(xì)胞(1.000±0.000)和Eca-109 TR37細(xì)胞(1.156±0.198)相比Eca-109 sh B7-H3細(xì)胞(0.197±0.042)B7-H3 m RNA表達(dá)水平顯著降低,對(duì)基因表達(dá)的沉默效率可達(dá)80%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而Eca-109細(xì)胞和Eca-109 TR37細(xì)胞B7-H3 m RNA的表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),Western Blot與Real time PCR法分析結(jié)果相一致。故選用Eca-109 sh B7-H3細(xì)胞和Eca-109 TR37細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3 MTS實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Eca-109 sh B7-H3細(xì)胞與Eca-109 TR37細(xì)胞的體外增殖能力無明顯差異(P0.05),流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,兩種細(xì)胞的細(xì)胞周期變化無明顯差異(P0.05),提示敲低B7-H3的表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞體外增殖能力無明顯影響。4劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組Eca-109 TR37細(xì)胞相比,Eca-109sh B7-H3細(xì)胞的平面遷移能力顯著下降,劃痕12h及24h后損傷愈合明顯較慢,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示敲低B7-H3的表達(dá)可降低Eca-109細(xì)胞的平面運(yùn)動(dòng)能力。5 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組Eca-109 TR37細(xì)胞相比,Eca-109 sh B7-H3細(xì)胞通過人工基底膜的數(shù)量顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示敲低B7-H3的表達(dá)可降低Eca-109細(xì)胞的侵襲能力。6流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組Eca-109 TR37細(xì)胞相比,Eca-109 sh B7-H3細(xì)胞的凋亡率顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示敲低B7-H3的表達(dá)可促進(jìn)Eca-109細(xì)胞的凋亡。7血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,使用培養(yǎng)Eca-109 sh B7-H3細(xì)胞48 h的上清液培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞8 h后,人血管內(nèi)皮細(xì)胞形成網(wǎng)狀小管的長(zhǎng)度顯著低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示敲低B7-H3的表達(dá)可降低Eca-109細(xì)胞的促血管生成能力。8裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)表明,在荷瘤28天后,實(shí)驗(yàn)組(注射Eca-109 sh B7-H3細(xì)胞)與對(duì)照組(注射Eca-109 TR37細(xì)胞)腫瘤的平均生長(zhǎng)大小無明顯差異(P0.05),提示敲低B7-H3的表達(dá)對(duì)Eca-109細(xì)胞的體內(nèi)增殖能力無影響。小結(jié):1食管癌細(xì)胞B7-H3表達(dá)水平顯著上調(diào),提示B7-H3可能參與了食管癌的腫瘤進(jìn)展。2敲低B7-H3表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞體內(nèi)外增殖能力無明顯影響,但可抑制食管癌細(xì)胞的體外遷移、侵襲和促血管生成能力,促進(jìn)食管癌細(xì)胞的凋亡。第二部分沉默B7-H3基因表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲能力抑制作用的機(jī)制研究目的:探討敲低B7-H3表達(dá)對(duì)抑制食管癌細(xì)胞侵襲的作用機(jī)制方法:1應(yīng)用Agilent Sure Print G3 Human Gene Expression chip(8×60K,Design ID:039494)對(duì)前期構(gòu)建的Eca-109 sh B7-H3和Eca-109 TR37細(xì)胞進(jìn)行差異基因表達(dá)分析,篩選出與B7-H3表達(dá)相關(guān)的基因。2結(jié)合功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果,通過Real time PCR、ELISA和Western Blott技術(shù)對(duì)篩選出的侵襲相關(guān)基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果:1從實(shí)驗(yàn)組Eca-109 sh B7-H3細(xì)胞與對(duì)照組Eca-109 TR37細(xì)胞中,篩選出差異表達(dá)基因126個(gè),其中49個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào),77個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào),差異倍數(shù)=2.0,P0.05。2 ELISA法分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組Eca-109 TR37細(xì)胞相比,Eca-109sh B7-H3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-6、VEGF分泌水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3 Real time PCR和Western Blot法分析結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組Eca-109sh B7-H3細(xì)胞與對(duì)照組Eca-109 TR37細(xì)胞相比,磷酸化Jak-2、磷酸化STAT-3、MMP-9、MMP-7的表達(dá)水平明顯降低,TIMP-1和EFEMP-1的表達(dá)水平明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。小結(jié):敲低食管癌細(xì)胞B7-H3的表達(dá),可通過抑制IL-6的分泌,降低Jak2/STAT3信號(hào)通路的活化,減少M(fèi)MP-7、MMP-9和VEGF的表達(dá),從而抑制食管癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
【關(guān)鍵詞】：B7-H3 食管癌 遷移 侵襲 凋亡 血管生成 基因芯片
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.1
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-14
• 英文縮寫14-16
• 引言16-18
• 第一部分 共刺激分子B7-H3對(duì)食管癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響18-53
• 前言18-19
• 材料與方法19-34
• 結(jié)果34-36
• 附圖36-47
• 附表47-48
• 討論48-50
• 小結(jié)50-51
• 參考文獻(xiàn)51-53
• 第二部分 沉默B7-H3基因表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲能力抑制作用的機(jī)制研究53-83
• 前言53-54
• 材料與方法54-63
• 結(jié)果63-65
• 附圖65-70
• 附表70-75
• 討論75-78
• 小結(jié)78-79
• 結(jié)論79-80
• 參考文獻(xiàn)80-83
• 綜述 共刺激分子B7-H3與消化系統(tǒng)腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展83-92
• 參考文獻(xiàn)88-92
• 致謝92-93
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷93

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：849028