本文關(guān)鍵詞：烷基亞硝胺在細胞色素P450作用下的代謝活化機理研究

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【摘要】：亞硝胺(NAs)是一種重要的環(huán)境致癌物,廣泛存在于水體、煙草、藥物、酒類和食品中,能夠?qū)е露喾N動物及人類發(fā)生腫瘤。研究表明,NAs在體內(nèi)經(jīng)細胞色素P450(CYP450)代謝活化后,生成羥基亞硝胺并進一步分解為活潑親電試劑——碳正離子,導(dǎo)致DNA堿基的烷化損傷,最終誘發(fā)癌癥。因此,CYP450催化NAs的代謝活化是其致癌的關(guān)鍵步驟,本課題使用量子化學(xué)計算方法對NAs的代謝活化反應(yīng)機理進行了研究,為深入闡明NAs的致癌作用機制提供了理論依據(jù)。使用密度泛函理論(density functional theory,DFT)UB3LYP方法在LANL2DZ(Fe)/6-31+G(d,p)(C,H,O,N,S)基組上對甲基乙基亞硝胺(N-Nitrosoethylmethylamine,NMEA)和二甲基亞硝胺(N-Nitrosodimethylamine,NDMA)在CYP450活性中心鐵卟啉催化下的代謝活化機理進行了研究,探討了在Cpd 0和Cpd I兩種鐵卟啉活性中心作用下NAs的Cα-H的羥基化過程。對反應(yīng)過程中各駐點的幾何結(jié)構(gòu)進行了優(yōu)化,并在更高的LANL2DZ(Fe)/6-311+G(d,p)(C,H,O,N,S)基組上進行了單點能計算。結(jié)果表明,CYP450催化NAs羥基化的過程包含兩個步驟——氫抽提反應(yīng)和回彈反應(yīng)。氫抽提反應(yīng)為控速步驟,氫原子從NAs轉(zhuǎn)移到鐵卟啉的Fe O上,是典型的氫原子傳遞(HAT)過程,緊接著鐵卟啉上的羥基回彈到NAs自由基上,形成羥基化代謝產(chǎn)物。低自旋的二線態(tài)(LS)和高自旋的四線態(tài)(HS)均參與反應(yīng),二者的能壘差別不大,符合雙態(tài)反應(yīng)性(TSR)。另外,Cpd I催化NMEA的反應(yīng)能壘為13.27/13.92 kcal/mol(LS/HS);Cpd 0催化NMEA的反應(yīng)能壘為18.96/18.89 kcal/mol(LS/HS),即Cpd I催化NAs羥基化比Cpd 0作為氧化活性中心更具有優(yōu)勢,反應(yīng)更容易發(fā)生。根據(jù)“雙區(qū)理論”提出的有關(guān)NAs致癌的作用機理,NAs分子側(cè)鏈上除了α-位可以發(fā)生羥基化代謝外,非α-位也可同時發(fā)生代謝進而生成兩個親電活性中心,最終導(dǎo)致DNA股間交聯(lián)。因此,本課題使用UB3LYP方法LANL2DZ+**(Fe)/6-311+G(d,p)(C,H,O,N,S)//LANL2DZ+**(Fe)/6-31+G(d,p)(C,H,O,N,S)基組上對Cpd I催化三種烷基亞硝胺(NMEA、NDEA和NMPA)Cβ-H羥基化的反應(yīng)機理進行了研究。結(jié)果表明,Nas的Cβ-H羥基化反應(yīng)過程與Cα-H羥基化過程相似,均為典型的HAT過程(即氫原子從NAs轉(zhuǎn)移到鐵卟啉Fe O上),緊接著經(jīng)歷羥基回彈過程形成羥基化產(chǎn)物。LS和HS也均參與了Cβ-H的羥基化反應(yīng),LS和HS的反應(yīng)能壘差別不大,符合雙態(tài)反應(yīng)性(TSR)。三種烷基NAs的Cβ-H羥基化能壘為16~19 kcal/mol,比Cα-H羥基化反應(yīng)能壘高3~5 kcal/mol,這表明Cα-H比Cβ-H更易于發(fā)生羥基化。另外,比較了Cα-H和Cβ-H羥基化反應(yīng)中的軌道能量和碳氫鍵解離能(BDE)。結(jié)果表明,在低自旋態(tài)下,NDEA的Cα-H過渡態(tài)的HOMO-LUMO能量差(?EHOMO-LUMO)比Cβ-H過渡態(tài)的?EHOMO-LUMO低約為14 kcal/mol,Cα-H的BDE比Cβ-H的BDE低6~11 kcal/mol,進一步證明了Cα-H比Cβ-H更易于在P450作用下代謝活化。使用分子對接方法對CYP450與不同結(jié)構(gòu)烷基亞硝胺的相互作用進行了研究,將10種人類CYP450和5種大鼠CYP450與8種NAs分子進行對接,通過比較GOLD打分函數(shù)的分值結(jié)合對接構(gòu)象,獲得了對接體系的合理結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,對接分數(shù)較高的P450亞型為2A6和2E1,而CYP2E1和CYP2A6這兩種酶在呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)均高度表達,因此這合理地解釋了體外模擬代謝實驗中觀察到的CYP2E1和CYP2A6代謝NAs時有較高代謝活性的現(xiàn)像,并會誘發(fā)肝癌、鼻咽癌和食管等器官產(chǎn)生腫瘤。從對接所得復(fù)合物的活性中心結(jié)構(gòu)可以看出,2A6活性中心的Thr275和2E1活性中心的Thr270是與NAs形成氫鍵的主要氨基酸殘基;Cα位H原子與鐵卟啉鐵原子的距離均約為4?,而Cβ-H原子與CYP450活性中心鐵卟啉的距離均在6?左右,表明α-碳原子離活性中心鐵卟啉距離更近,因而更有利于被代謝活化。本研究不僅闡明了P450催化NAs代謝活化的反應(yīng)機理,而且提出了非α-位代謝活化可能是亞硝胺致癌作用中不可忽視的重要因素。本研究對深入揭示亞硝胺的致癌作用機理具有重要意義,為亞硝胺分子結(jié)構(gòu)與致癌活性關(guān)系研究提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：亞硝胺 細胞色素P450 羥基化反應(yīng) 代謝活化 密度泛函理論
【學(xué)位授予單位】：北京工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 緒論11-25
• 1.1 研究背景11-12
• 1.2 N-亞硝基類化合物簡介12-16
• 1.2.1 N-亞硝基類化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)介12
• 1.2.2 N-亞硝基類化合物自然界的存在和生物合成12-13
• 1.2.3 N-亞硝基類化合物致癌作用13-16
• 1.3 細胞色素P450酶16-22
• 1.3.1 細胞色素P450的結(jié)構(gòu)及功能16-18
• 1.3.2 細胞色素P450酶催化化合物代謝18-21
• 1.3.3 亞硝胺在細胞色素P450作用下代謝活化21-22
• 1.4 本論文的主要研究工作22-25
• 第2章 烷基亞硝胺在鐵卟啉的兩種活性中心作用下羥基化代謝機理25-39
• 2.1 引言25-26
• 2.2 計算模型與方法26-27
• 2.3 結(jié)果與討論27-38
• 2.3.1 細胞色素P450的兩種活性中心的比較27-35
• 2.3.2 溶液環(huán)境對兩種活性中心的影響35-38
• 2.4 本章小結(jié)38-39
• 第3章 P450催化下亞硝胺C~α-H和C~β-H羥基化代謝機理39-57
• 3.1 引言39-40
• 3.2 計算模型與方法40
• 3.3 結(jié)果與討論40-55
• 3.3.1 Cpd I作用下亞硝胺C~α-H羥基化代謝過程40-45
• 3.3.2 Cpd I作用下亞硝胺C~β-H羥基化代謝過程45-53
• 3.3.3 Cpd I催化亞硝胺同分異構(gòu)體羥基化代謝及其C-H鍵解離能53-55
• 3.4 本章小結(jié)55-57
• 第4章 亞硝胺與細胞色素P450酶的分子對接研究57-75
• 4.1 引言57-58
• 4.2 受體分子的準(zhǔn)備及分子對接的方法58-61
• 4.2.1 人類細胞色素P450酶的準(zhǔn)備58-59
• 4.2.2 大鼠細胞色素P450酶的準(zhǔn)備59-60
• 4.2.3 亞硝胺與CY P450對接方法60-61
• 4.3 結(jié)果與討論61-73
• 4.3.1 亞硝胺與人類細胞色素P450酶的分子對接研究61-70
• 4.3.2 亞硝胺與大鼠細胞色素P450酶的分子對接研究70-73
• 4.4 本章小結(jié)73-75
• 結(jié)論75-77
• 參考文獻77-85
• 攻讀碩士期間所發(fā)表的學(xué)術(shù)論文85-87
• 致謝87

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