本文關(guān)鍵詞：自噬對肝癌HepG2細(xì)胞和正常肝L-02細(xì)胞作用的差異及相關(guān)分子機(jī)制

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【摘要】：背景:腫瘤在當(dāng)今世界的全球死亡原因中位居第二位。原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)惡性程度高,發(fā)展迅速,容易復(fù)發(fā)的特點,使大部分患者在就診時已經(jīng)是晚期,失去了手術(shù)的最佳時機(jī),而且肝癌對化療亦不敏感。故只有通過對于癌癥的發(fā)生及其發(fā)展機(jī)制的不斷深入研究,才能取得更有效的預(yù)防和治療方法。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi),由各種原因引起的蛋白質(zhì)錯誤折疊及錯誤折疊的蛋白質(zhì)的積累,被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激刺激過強(qiáng),除了可以導(dǎo)致細(xì)胞經(jīng)凋亡途徑死亡外,還可以經(jīng)II型程序性死亡方式-自噬。自噬是由基因調(diào)控并在進(jìn)化上保守的介導(dǎo)的細(xì)胞自我消化的途徑,充當(dāng)腫瘤發(fā)生的動態(tài)監(jiān)管機(jī)制。自噬對細(xì)胞的分化和發(fā)育起至關(guān)重要的作用,它是細(xì)胞對惡劣環(huán)境及壓力的一種反應(yīng),但其對細(xì)胞生存的意義并不清楚。ERS的發(fā)生可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。BCL-2是從人類復(fù)發(fā)性濾泡性淋巴瘤染色體易位的斷點區(qū)被確定的凋亡基因。Bcl-2家族蛋白不僅參與I型程序性細(xì)胞死亡(即凋亡),還參與了II型程序性死亡(即自噬)的調(diào)控。細(xì)胞自噬可防止抗腫瘤藥誘導(dǎo)的凋亡,促進(jìn)腫瘤耐藥。然而,自噬性細(xì)胞死亡可能是凋亡耐受腫瘤細(xì)胞的一種死亡方式。本實驗主要探索在ERS狀態(tài)下,自噬對肝癌Hep G2細(xì)胞及肝正常L-02細(xì)胞作用的差異,及通過對Bcl-2基因的研究,了解凋亡與自噬的關(guān)系,以期能夠為提高肝癌治療效果尋找新的策略。第一部分觀察自噬抑制劑在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下對肝癌Hep G2細(xì)胞和正常肝L-02細(xì)胞作用的差異目的:觀察自噬在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)狀態(tài)下對肝癌Hep G2細(xì)胞和正常肝細(xì)胞L-02作用的差異。方法:體外常規(guī)培養(yǎng)的人肝癌Hep G2細(xì)胞和正常肝L-02細(xì)胞,分別給予衣霉素(TM)單藥和TM聯(lián)合自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(TM+3-MA)或氯喹(TM+CQ)作用12、24、48 h后,采用MTT法檢測細(xì)胞活力變化,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率,Western blot法檢測自噬蛋白LC3、抗凋亡蛋白Bcl-2的變化。結(jié)果:TM可引起Hep G2細(xì)胞和L-02細(xì)胞死亡并呈時間依賴關(guān)系,3-MA或CQ均可增加TM對Hep G2細(xì)胞的生長抑制作用,24 h細(xì)胞存活率分別為TM+3-MA(60%)、TM+CQ(72%)、TM(86%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);但對于L-02細(xì)胞,其存活率分別為83%、84%、83%,活力沒有明顯差異;Annexin V/PI凋亡實驗顯示TM+3-MA、TM+CQ和TM組對Hep G2細(xì)胞的凋亡率分別為15%、11%和7%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),但對L-02細(xì)胞組,凋亡率分別為16%、17%、16%,未見明顯差別;免疫印跡結(jié)果顯示TM引起自噬增加,自噬抑制劑3-MA與CQ可引起兩種細(xì)胞自噬作用減弱;同時,在Hep G2細(xì)胞中,加入自噬抑制劑后,Bcl-2基因表達(dá)下調(diào),而在L-02細(xì)胞中,Bcl-2基因低表達(dá)且未見明顯變化。結(jié)論:自噬抑制劑(或3-MA或CQ)均可顯著增加TM對肝癌Hep G2細(xì)胞的生長抑制,但對正常肝L-02細(xì)胞的生長抑制作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義;在Hep G2細(xì)胞中,加入自噬抑制劑后,Bcl-2基因表達(dá)下調(diào),而在L-02中未見明顯差異。因此,可以認(rèn)為自噬在ERS狀態(tài)下可對癌細(xì)胞的生存提供保護(hù),但對正常細(xì)胞無保護(hù)作用;同時,Bcl-2基因或是導(dǎo)致這一差異的分子機(jī)制之一。第二部分初步探討B(tài)cl-2基因或是自噬對肝癌Hep G2細(xì)胞提供生存保護(hù)的分子機(jī)制之一目的:研究在ERS狀態(tài)下,因Bcl-2基因在肝癌Hep G2細(xì)胞和正常肝細(xì)胞L-02中表達(dá)的差異,導(dǎo)致自噬可為肝癌Hep G2細(xì)胞提供生存保護(hù)。方法:體外常規(guī)培養(yǎng)人肝癌Hep G2細(xì)胞和正常肝L-02細(xì)胞,給以Bcl-2的si RNA敲除Bcl-2基因,設(shè)空白對照組,NC+TM組,si RNA+TM組,單藥TM組分別作用24h后,采用MTT法檢測細(xì)胞活力變化,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率,Western blot法檢測抗調(diào)亡蛋白Bcl-2的變化。結(jié)果:轉(zhuǎn)染si RNA下調(diào)Bcl-2的基因后,MTT結(jié)果顯示:Hep G2細(xì)胞中,si RNA+TM組細(xì)胞存活率為70%,較TM單藥組細(xì)胞存活率(88%)顯著下降,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);L-02細(xì)胞組中si RNA+TM組細(xì)胞存活率為86%,與TM單藥組細(xì)胞存活率(81%)相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。流式結(jié)果顯示:si RNA+TM組作用Hep G2細(xì)胞24 h后,Hep G2細(xì)胞凋亡率(11.17%)顯著高于TM組(7.78%),差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);而L-02組24 h,各實驗組間凋亡率(NC:19.60%、si RNA+TM:19.45%、TM:19.89%)未見明顯差異。Western blot法檢測顯示:Hep G2細(xì)胞組中,轉(zhuǎn)染組Bcl-2/actin的灰度比值較TM單藥組顯著下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);而L-02細(xì)胞組中,幾乎未見Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)論:在TM誘導(dǎo)ERS狀態(tài)作用下,用si RNA下調(diào)Bcl-2基因可明顯增加Hep G2細(xì)胞的生長抑制率,但對正常肝細(xì)胞L-02的生長抑制無統(tǒng)計學(xué)意義。因此,可以認(rèn)為Bcl-2基因在肝癌Hep G2細(xì)胞和正常肝細(xì)胞L-02中存在差異,且這種差異是自噬對肝癌Hep G2細(xì)胞提供生存保護(hù)的分子機(jī)制之一。
【關(guān)鍵詞】：自噬抑制劑 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 肝癌 肝正常細(xì)胞 Bcl-2-siRNA 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 肝癌 肝正常細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
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本文編號：843007