本文關(guān)鍵詞：小G蛋白Ran在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用與機制研究

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【摘要】：【背景】結(jié)直腸癌是危害人類生命健康的惡性腫瘤之一。最新全球癌癥統(tǒng)計結(jié)果顯示,2012年度全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例140萬左右,死亡病例693900,其中發(fā)病率在男性中排名第三,女性中排名第二,死亡率在男性中排名第四,女性排名第三。在我國隨著人民生活水平的提高,誘發(fā)結(jié)直腸癌的高危因素也在同步廣泛流行,包括人口老齡化的發(fā)生、不健康的飲食方式、肥胖、吸煙等,因而近年來結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升。而腫瘤的轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌致死的主要原因,也是影響患者預(yù)后的重要因素。為了探究結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制,我們課題組為此展開了系列研究。MC3是我們實驗室前期自主建立的一株結(jié)腸癌特異單抗,我們鑒定出其識別的抗原為Txl-2,后期發(fā)現(xiàn)Txl-2的剪接體Txl-2b與小G蛋白Ran相互作用,顯著促進結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移。在此基礎(chǔ)上,我們對Ran做了功能學(xué)驗證和機制探索。結(jié)果顯示Ran在結(jié)直腸癌組織中、胃癌組織中、胰腺癌組織中的表達顯著高于正常組織,并且其高表達與腫瘤的分期及轉(zhuǎn)移成正相關(guān)[1,2]。在結(jié)直腸癌細胞和胰腺癌細胞中,干擾Ran的表達可引起細胞體內(nèi)體外增殖能力減弱。在胰腺癌細胞,Ran表達的下調(diào)可引起細胞凋亡增加,細胞遷移及侵襲能力明顯下降,研究還發(fā)現(xiàn)其調(diào)控機制與細胞周期相關(guān)蛋白及存活素Survivin表達下調(diào),凋亡蛋白cleaved Caspase-3表達上調(diào)有關(guān)。而其促進侵襲轉(zhuǎn)移的機制則與雄激素受體Androgen Receptor、趨化因子CXCR4可能相關(guān)。研究至此,尚無直接證據(jù)證明Ran可以促進結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移,同時Ran在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機制仍不清楚。【目的】1.檢測并分析Ran在結(jié)直腸癌中病理組織及細胞系中的表達與轉(zhuǎn)移的關(guān)系。2.研究Ran對結(jié)直腸癌細胞系遷移侵襲能力的影響。3.探索Ran促進結(jié)直腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制�！痉椒ā�1.小G蛋白Ran在組織與細胞中的表達檢測:(1)免疫組織化學(xué)檢測Ran在結(jié)直腸癌原發(fā)灶和配對陽性淋巴結(jié)中的表達,分析Ran的表達強度與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系。(2)Western blot檢測Ran在永生化正常腸上皮細胞HIEC、結(jié)直腸癌細胞系SW480、SW620、HCT116、Caco-2、HT-29、Lo Vo核蛋白中的表達情況。(3)免疫熒光檢測Ran在結(jié)直腸癌細胞SW480、SW620的亞細胞定位情況及熒光表達強弱情況。2.構(gòu)建Ran的功能獲得、功能缺失細胞模型:(1)將Ran特異性O(shè)ligo si RNA轉(zhuǎn)染入結(jié)直腸癌細胞,在蛋白水平驗證通過Western blot驗證si RNA的干擾效果。(2)將最有效的的si RNA包裝構(gòu)建成慢病毒,穩(wěn)定下調(diào)Ran的表達,并通過Western blot和熒光檢測進行驗證。(3)構(gòu)建并轉(zhuǎn)染過表達Ran的慢病毒,并通過Western blot進行過表達驗證。3.Ran對結(jié)直腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響:(1)體外實驗通過Transwell遷移和侵襲實驗觀察Ran的功能獲得和功能缺失細胞模型遷移和侵襲能力的變化。(2)體內(nèi)實驗通過裸鼠尾靜脈轉(zhuǎn)移觀察Ran功能獲得和功能缺失細胞模型在體內(nèi)侵襲能力的變化。4.Ran調(diào)控結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制研究(1)利用Nanostring檢測技術(shù)探索Ran下游的分子表達變化及可能的信號通路。(2)利用高通量表達譜芯片探索Ran下游的分子表達變化及可能的信號通路。(3)通過RNAi技術(shù)、Western blot檢測雄激素受體AR、LIN28B與Ran的表達失調(diào)的關(guān)系,通過Transwell遷移實驗驗證AR、LIN28B在結(jié)直腸癌細胞遷移能力中的影響�！窘Y(jié)果】1.在34例結(jié)直腸癌組織及其配對的陽性淋巴結(jié)標本中,免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示Ran在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移灶(陽性淋巴結(jié))中的陽性表達率明顯高于結(jié)直腸癌原發(fā)灶中的表達,P0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義。2.結(jié)直腸癌細胞系及永生化正常腸上皮細胞的核蛋白中Ran表達存在差異,在人永生化正常腸上皮細胞HIEC表達極少,在高轉(zhuǎn)移細胞系SW620、HCT116、Caco-2中Ran的表達明顯高于低轉(zhuǎn)移細胞系SW480、HT-29。3.免疫熒光結(jié)果顯示,Ran主要定位于細胞核中,且高低轉(zhuǎn)移細胞系SW620和SW480中Ran的表達存在差異。4.合成的Ran特異的Oligo siRNA經(jīng)過轉(zhuǎn)染和驗證,si-1干擾效果最好,經(jīng)過慢病毒包裝后,在高轉(zhuǎn)移細胞系HCT116中進行慢病毒轉(zhuǎn)染,經(jīng)過嘌呤霉素篩選后,通過Western blot和熒光顯影檢測,成功構(gòu)建了Ran的表達下調(diào)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系HCT116-si Ran及對照HCT116-si NC。5.通過對低轉(zhuǎn)移細胞系SW480進行過表達慢病毒的轉(zhuǎn)染及續(xù)嘌呤霉素篩選,成功構(gòu)建了過表達Ran的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系SW480-Ran及對照SW480-NC。6.體外實驗Transwell結(jié)果顯示細胞系HCT116-si Ran的侵襲遷移能力較對照細胞系明顯減弱,細胞系SW480-Ran的侵襲遷移能力較對照組明顯增強。該結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析有意義。7.體內(nèi)裸鼠尾靜脈轉(zhuǎn)移實驗顯示細胞系HCT116-si Ran裸鼠肝臟中形成的轉(zhuǎn)移瘤較對照組明顯減少,細胞系SW480-Ran在肝臟中形成的轉(zhuǎn)移灶則明顯多于對照組,且HCT116-si RAN組裸鼠的生存期較對照組延長,體重動態(tài)變化在第18天出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異。8.細胞系Sw480-Ran中AR與LIN28B的表達均發(fā)生了上調(diào),而在Caco-2細胞中,干擾Ran的表達后AR、LIN28B的表達發(fā)生了下降。Ran、AR、LIN28B均主要表達在細胞核中,在Ran的表達下調(diào)后,AR、LIN28B的熒光表達也相應(yīng)的減弱。且干擾AR、LIN28B表達后可以減弱結(jié)直腸癌細胞的遷移能力。9.通過送檢Nanostring以及高通量的表達譜芯片,對Ran的下游分子機制進行探索,篩選出一批差異表達的基因,我們后續(xù)將利用這些大數(shù)據(jù)對Ran下游的信號通路及分子事件進行生物信息學(xué)的分析,明確下游事件的發(fā)生�！窘Y(jié)論】1.Ran在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移灶組織中的表達高于原發(fā)灶組織,在高轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌細胞系中的表達高于低轉(zhuǎn)移細胞系。2.體內(nèi)體外實驗證明了小G蛋白Ran能夠促進結(jié)直腸癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。3.小G蛋白Ran可能是通過AR、LIN28B調(diào)控結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移,作用機制有待進一步深入研究。4.篩選到了大批Ran下游的差異基因,有助于全面分析Ran下游的分子事件。
【關(guān)鍵詞】：Ran 結(jié)直腸癌 侵襲轉(zhuǎn)移 分子機制
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-12
• ABSTRACT12-17
• 前言17-18
• 文獻回顧18-27
• 第一部分 Ran在結(jié)直腸癌病理組織和細胞系中的表達、定位27-38
• 1 材料27-29
• 1.1 細胞系27
• 1.2 組織芯片27
• 1.3 主要實驗試劑27-28
• 1.4 主要實驗儀器28-29
• 2 方法29-34
• 2.1 細胞培養(yǎng)29
• 2.2 免疫組織化學(xué)染色29-31
• 2.3 Western Blot31-33
• 2.4 免疫熒光33-34
• 3 結(jié)果34-36
• 3.1 Ran在結(jié)直腸癌組織原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶中的表達34-35
• 3.2 Ran在結(jié)直腸癌細胞系核蛋白中表達35
• 3.3 Ran在結(jié)直腸癌細胞中的亞細胞定位35-36
• 4 討論36-38
• 第二部分 慢病毒表達載體的構(gòu)建和Ran功能獲得與缺失模型的建立38-46
• 1 材料38-40
• 1.1 Oligo siRNA-Ran的設(shè)計合成38
• 1.2 慢病毒包裝38-39
• 1.3 主要試劑39-40
• 1.4 主要實驗儀器40
• 2 方法40-42
• 2.1 細胞培養(yǎng)40
• 2.2 細胞瞬時轉(zhuǎn)染及干擾效果驗證40-41
• 2.3 慢病毒干擾細胞系及轉(zhuǎn)染效率驗證41-42
• 3 結(jié)果42-45
• 3.1 Oligo siRNA-Ran瞬時轉(zhuǎn)染效果驗證42-43
• 3.2 功能缺失模型的建立43-44
• 3.3 功能獲得模型的建立44-45
• 4 討論45-46
• 第三部分 Ran對結(jié)直腸癌細胞轉(zhuǎn)移能力的影響46-53
• 1 材料46-47
• 1.1 功能缺失和功能獲得的細胞模型46
• 1.2 主要試劑46
• 1.3 主要實驗儀器46-47
• 1.4 實驗動物47
• 2 方法47-48
• 2.1 細胞培養(yǎng)47
• 2.2 Transwell遷移實驗47
• 2.3 Transwell侵襲實驗47-48
• 2.4 裸鼠尾靜脈轉(zhuǎn)移實驗48
• 2.5 統(tǒng)計學(xué)分析48
• 3 結(jié)果48-50
• 3.1 Transwell法檢測Ran對結(jié)直腸癌細胞體外系遷移和侵襲能力的影響48-49
• 3.2 裸鼠尾靜脈轉(zhuǎn)移實驗檢測Ran對結(jié)直腸癌細胞系體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響49-50
• 4 討論50-53
• 第四部分 Ran促進結(jié)直腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制研究53-65
• 1 材料53-55
• 1.1 細胞系53
• 1.2Nanostring53
• 1.3 基因芯片53
• 1.4 主要試劑53-54
• 1.5 主要儀器54-55
• 2 方法55-57
• 2.1 細胞培養(yǎng)55
• 2.2 下游靶分子驗證55-56
• 2.3 細胞RNA樣本送檢Nanostring56
• 2.4 細胞RNA樣本送檢基因芯片56-57
• 3 結(jié)果57-63
• 3.1 下游靶分子驗證57-59
• 3.2 Nanostring59-61
• 3.3 表達譜芯片61-63
• 4 討論63-65
• 小結(jié)65-66
• 參考文獻66-73
• 個人簡歷和研究成果73-74
• 致謝74

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 范紅偉;盧瑗瑗;吳瓊;顧勇;安艷新;王新;;Ran在胃癌中的表達及其臨床意義[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2012年08期

2 鄧林;盧瑗瑗;孫藝;郭學(xué)剛;;小G蛋白Ran對胰腺癌細胞增殖和凋亡的調(diào)控[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2013年04期

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本文編號：841569