本文關(guān)鍵詞：經(jīng)典Wnt信號(hào)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

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【摘要】：背景介紹Wnt基因廣泛存在于無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物,并且在不同物種具有高度的保守性。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路參與多種生理和病理機(jī)制,調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞極性、遷移、凋亡等一系列重要過(guò)程,尤其在各種干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等生命活動(dòng)活躍的細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用。迄今研究表明,經(jīng)典Wnt信號(hào)功能失調(diào)與多種癌癥的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān),不僅參與惡性腫瘤的發(fā)生,而且促進(jìn)其發(fā)展和轉(zhuǎn)移,包括乳腺癌、胃癌、食管癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤等。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)指上皮樣細(xì)胞在特定的生理或病理環(huán)境中向間質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變分化的現(xiàn)象,其逆向過(guò)程稱為間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal epithelial transition,MET)。生理性EMT/MET多見(jiàn)于胚胎發(fā)育和組織愈合修復(fù),而病理性EMT主要參與某些組織的纖維化及惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,是腫瘤細(xì)胞局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。在EMT過(guò)程中,上皮起源的細(xì)胞失去其上皮樣表型并逐漸獲得間質(zhì)樣細(xì)胞表型,即細(xì)胞極性消失,細(xì)胞間的緊密連接減少,黏附能力降低,單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)不能維持,細(xì)胞的遷移、游走能力增加,從而表現(xiàn)出侵襲轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)。EMT細(xì)胞的典型分子表型變化主要是上皮細(xì)胞標(biāo)志物E型鈣黏蛋白(epithelium-cadherin,E-cad)等表達(dá)降低,而N型鈣黏蛋白(N-cadherin,N-cad)、波形蛋白(Vimentin,Vim)等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)升高;且多種轉(zhuǎn)錄因子也相應(yīng)呈現(xiàn)一系列變化。EMT受多種分子信號(hào)通路調(diào)控,目前研究表明,經(jīng)典Wnt信號(hào)通路(又稱Wnt/β-catenin通路)參與某些生理和病理的EMT/MET的調(diào)節(jié)。如在小鼠腎小管發(fā)育中,敲除Wnt基因可有效阻斷間質(zhì)樣細(xì)胞遷移和組織局部腎小管上皮細(xì)胞的形成,采用基因敲除的方法干擾Wnt/β-catenin信號(hào)通路,顯著影響EMT介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移病灶的發(fā)生,顯示了該通路在腫瘤轉(zhuǎn)移中的重要意義,提示針對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的靶向性治療具有阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在意義。目前已證實(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路失調(diào)是結(jié)腸癌發(fā)病的重要誘因,該通路是否促進(jìn)結(jié)腸癌的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移尚需進(jìn)一步研究。目的本實(shí)驗(yàn)選用體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,利用基因重組蛋白Dkk1和Wnt3a分別抑制和激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polimerase chain reaction,PCR),觀察Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性改變對(duì)細(xì)胞遷移的影響以及對(duì)EMT特征性分子和相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因表達(dá)的影響,從而確定Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT的調(diào)控作用。方法1.HCT116細(xì)胞的體外培養(yǎng)。結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞庫(kù),用含10%胎牛血清(Fetal bovine Serum,FBS)的My Coy’s 5a培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液,以1×105/ml密度接種(5ml/瓶),置于37?C,5%CO2和飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),定期觀察。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至大約覆蓋培養(yǎng)瓶底部90%時(shí),按照1:5的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。2.實(shí)驗(yàn)分組。HCT116細(xì)胞分為三組分別是:(1)對(duì)照組:HCT116細(xì)胞;(2)抑制劑組:HCT116細(xì)胞+Dkk1(100ng/ml);(3)激動(dòng)劑組:HCT116細(xì)胞+Wnt3a(40ng/ml)。采用常規(guī)培養(yǎng)液制備HCT116的單細(xì)胞懸液,以1×106/孔的密度接種于六孔板,每組設(shè)3個(gè)平行孔。24h后待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)時(shí)開(kāi)始上述抑制劑和激動(dòng)劑的處理。3.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。HCT116細(xì)胞培養(yǎng)24h后,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),覆蓋大約80%的培養(yǎng)板表面。用無(wú)菌槍頭在六孔板每孔中央沿直徑方向畫一條粗細(xì)均勻的劃痕,仔細(xì)刮去劃痕線右側(cè)所有的細(xì)胞,保留左側(cè)細(xì)胞完好。棄去培養(yǎng)基并用PBS沖洗3次除去漂浮的細(xì)胞,換成含2%FBS的My Coy’s 5a培養(yǎng)基,并按上述分組所示加入Dkk1(100ng/ml)或Wnt3a(40ng/ml)。此時(shí)記為0h,使用倒置顯微鏡在每孔中沿劃痕線從上至下劃分為8個(gè)連續(xù)的觀察視野,分別在0h、12h、24h、48h時(shí),觀察各個(gè)視野中的細(xì)胞遷移情況并采集圖片,將得到的細(xì)胞圖像數(shù)據(jù)用Image Pro Plus 6.2進(jìn)行分析處理,分別計(jì)算對(duì)照組、抑制劑組和激動(dòng)劑組越過(guò)劃?rùn)M線的細(xì)胞數(shù)。4.細(xì)胞周期檢測(cè)。HCT116細(xì)胞培養(yǎng)24h后,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng);按照方法2分組處理48h后,收集3組細(xì)胞,PBS清洗3次,用冷無(wú)水乙醇固定過(guò)夜,離心后加入碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)和RNA酶混合的DNA染色溶液(每樣本200μl)重懸混勻,室溫下避光孵育30min后,PBS清洗3次,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果采用細(xì)胞周期擬和軟件Mod Fit進(jìn)行分析。5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因、EMT特征性分子及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的基因表達(dá)變化。采用總RNA提取試劑盒分別提取處理48h后對(duì)照組、抑制劑組和激動(dòng)劑組的總RNA,使用Nanodrop精確測(cè)定RNA濃度和純度,各樣本以等量的總RNA反轉(zhuǎn)錄為c DNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組基因表達(dá)變化,包括:Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因β-catenin,Axin2,C-myc,Wntless;EMT特征性分子的基因E-cad,N-cad,Vim;參與EMT的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因Slug,Snail,ZEB1,ZEB2,Twist,MMP2,MMP3。β-actin為內(nèi)參基因,ROX為加樣參照熒光。根據(jù)-σTT分別計(jì)算抑制劑組和激動(dòng)劑組與對(duì)照組基因表達(dá)量的相對(duì)比值。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,使用SPSS10.1統(tǒng)計(jì)軟件,采用t檢驗(yàn)法分別將抑制劑組和激動(dòng)劑組與對(duì)照組進(jìn)行分析比較,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果1.HCT116細(xì)胞按1:5傳代,呈單層聚集生長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)為上皮樣細(xì)胞,呈多邊形、卵圓形,細(xì)胞增殖能力旺盛,細(xì)胞之間連接緊密,胞間沒(méi)有空隙,連續(xù)傳代的細(xì)胞不出現(xiàn)可識(shí)別的形態(tài)及生長(zhǎng)特性的改變。2.調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的活性,通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)可以看出,對(duì)照組至24h時(shí)才發(fā)生明顯細(xì)胞遷移;激動(dòng)劑組(Wnt3a-40ng/ml)在12h時(shí)就可以觀察到細(xì)胞遷移;抑制劑組(Dkk1-100ng/ml)在實(shí)驗(yàn)觀察的48h內(nèi)始終沒(méi)有明顯的細(xì)胞遷移現(xiàn)象。3.調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的活性,并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,結(jié)果顯示,對(duì)照組處于S期的細(xì)胞占10.2%±0.45%,抑制劑組處于S期的細(xì)胞占9.4%±0.2%,激動(dòng)劑組處于S期的細(xì)胞占11.1%±0.3%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,抑制劑組和激動(dòng)劑組分別與對(duì)照組的S期細(xì)胞相比,差異無(wú)顯著性。4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,采用Wnt3a(40ng/ml)處理48h顯著激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,表現(xiàn)為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵基因β-catenin和相關(guān)調(diào)控基因Wntless的表達(dá)顯著上調(diào);同時(shí),上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cad表達(dá)下調(diào),而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cad、Vim等表達(dá)顯著上調(diào)。當(dāng)采用Dkk1(100ng/ml)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性時(shí),上述基因表達(dá)呈現(xiàn)相反的變化。統(tǒng)計(jì)分析顯示,抑制劑組和激動(dòng)劑組分別與對(duì)照組相比,差異具有顯著性(p0.05)。5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果還顯示,EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子也出現(xiàn)明顯變化。當(dāng)Wnt3a(40ng/ml)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路時(shí),轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Snail、Slug、ZEB1、Twist、MMP3表達(dá)均上調(diào)。相反,當(dāng)采用Dkk1抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路時(shí),上述基因表達(dá)下調(diào)。統(tǒng)計(jì)分析顯示,抑制劑組和激動(dòng)劑組分別與對(duì)照組相比,差異具有顯著性(p0.05)。結(jié)論1.體外培養(yǎng)條件下,經(jīng)典Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,激活該信號(hào)通絡(luò)可促進(jìn)細(xì)胞遷移和間質(zhì)樣細(xì)胞表型,抑制該信號(hào)通路結(jié)果相反。2.經(jīng)典Wnt信號(hào)通路對(duì)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用可能與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Slug、Snail、ZEB1、Twist、MMP3相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)腸癌 經(jīng)典Wnt信號(hào)通路 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.35
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-14
• 英文縮略詞表14-15
• 前言15-18
• 材料與方法18-27
• 結(jié)果27-35
• 討論35-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-42
• 綜述部分42-59
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷59-60
• 致謝60

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