本文關(guān)鍵詞：新疆北疆部分地區(qū)HPV的分子流行病學(xué)調(diào)查及其雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立

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【摘要】：宮頸癌是最常見的女性惡性腫瘤之一,而高危型人乳頭瘤病毒(High-risk human papillomavirus,HR-HPV)的持續(xù)感染與宮頸癌的發(fā)生關(guān)系最為密切。目前宮頸癌的發(fā)生率逐漸升高,并呈年強(qiáng)化趨勢(shì)發(fā)展,這不僅嚴(yán)重影響著婦女的生活質(zhì)量,也給婦女的生命及健康帶來嚴(yán)重的威脅。因此明確某一地區(qū)HPV的感染現(xiàn)狀以及流行型別,并了解宮頸病變樣本中HPV的基因變異狀況,這對(duì)指導(dǎo)HPV疫苗的應(yīng)用推廣和新一代疫苗的設(shè)計(jì)研究以及新的檢測(cè)方法的建立具有重要的意義。新疆處于我國西北地區(qū),其宮頸癌的發(fā)生率較高,尤其是在新疆南部少數(shù)民族聚集的區(qū)域,但目前對(duì)于新疆北疆地區(qū)HPV的流行狀況以及疫苗還沒有研究。本實(shí)驗(yàn)對(duì)新疆北疆部分地區(qū)的HPV的流行狀況以及宮頸病變樣本中HPV基因型的分布以及多重感染與宮頸病變的關(guān)系進(jìn)行了研究。并在此基礎(chǔ)上通過對(duì)基因變異情況的分析來研究適合該地區(qū)的HPV疫苗和和建立。研究方法和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.新疆北疆部分地區(qū)HPV的流行狀況HPV的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要原因。為了研究新疆北疆部分地區(qū)HPV的流行狀況,和宮頸病變?nèi)巳褐蠬PV基因型的分布,以及多重感染情況。我們收集了2010年1月-2014年12月就診于新疆石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科進(jìn)行第二代雜交捕獲法(Hybrid Capture 2,HC2)檢測(cè)的7298位病人的病例資料,并收集了2014年1月-2014年12月就診病人的宮頸脫落細(xì)胞樣本,篩選出經(jīng)病理學(xué)診斷有宮頸病變病人的宮頸脫落細(xì)胞樣本,并對(duì)其進(jìn)行分子檢測(cè),結(jié)果顯示:(1)新疆北疆地區(qū)人乳頭病毒的發(fā)生率仍處于一個(gè)較高的水平,其中年齡25歲和≥55歲時(shí)出現(xiàn)感染高峰;(2)HR-HPV的檢出率隨著宮頸病變等級(jí)的增加而增加,而低危型人乳頭瘤病毒的感染率(Low-risk human papillomavirus,LR-HPV)隨宮頸病變程度的變化而變化不大;(3)在新疆北疆部分地區(qū)至少存在29種HPV基因型,其中HR-HPV 17種,LR-HPV 12種,其中發(fā)生率較高的HR-HPV基因型依次為HPV 16、53、52、58、35;(4)在多重感染檢測(cè)中,主要以二重感染為主,其中以HPV 16型的合并感染最為常見,還出現(xiàn)了三重、四重、五重、六重感染,并且多重感染與宮頸病變的嚴(yán)重程度無關(guān)。2.HPV流行基因型L1基因的克隆與分析為了研究新疆北疆地區(qū)流行的主要HR-HPV L1基因的變異情況,設(shè)計(jì)了能夠擴(kuò)增HPV 16、52、53、58以及在世界范圍內(nèi)發(fā)生率較高且致癌性較強(qiáng)的HPV 18型的L1全長序列的引物,并經(jīng)過測(cè)序、拼接、比對(duì)后獲得L1基因序列全長。通過與現(xiàn)有的疫苗株和美國株序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn),在核酸水平上均發(fā)生了突變,有些堿基突變甚至導(dǎo)致了氨基酸的改變。以HPV 16 L1基因?yàn)槔?對(duì)新疆株與疫苗株進(jìn)行分子生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)兩者之間存在差異。這為新疆北疆地區(qū)疫苗的引進(jìn)以及多價(jià)疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)。同時(shí)本章還參照以往報(bào)道,篩選出保守性較好的多肽片段,為下一章節(jié)單克隆抗體的制備奠定基礎(chǔ)。3.HPV 16型單克隆抗體的檢測(cè)以及雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立為了建立適合新疆北疆地區(qū)自身發(fā)展特點(diǎn)的HPV檢測(cè)方法,本研究在實(shí)驗(yàn)二的篩選得出的保守片段基礎(chǔ)上,對(duì)多肽片段進(jìn)行合成,并進(jìn)行KLH偶聯(lián),然后免疫小鼠,最終獲得15株含有單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清,Western blot檢測(cè)后,篩選出兩株特異性較好的細(xì)胞株,并對(duì)其進(jìn)行純化,其中一株純化的單抗進(jìn)行辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)標(biāo)記后作為檢測(cè)抗體,另一株純化單抗作為捕獲抗體,以此為基礎(chǔ)建立檢測(cè)HPV的雙抗體夾心ELISA法。通過對(duì)抗體稀釋液等條件進(jìn)行優(yōu)化,確定捕獲抗體的最佳濃度為1.69μg/m L,檢測(cè)抗體的工作效價(jià)為1:100,樣品反應(yīng)時(shí)間為45 min;酶標(biāo)抗體作用時(shí)間為40 min;顯色時(shí)間為15 min,用建立的雙抗體夾心ELISA方法與TS-PCR(Type-Specific Polymerase Chain Reaction,TS-PCR)方法同時(shí)檢測(cè)66份臨床宮頸脫落細(xì)胞樣本,符合率達(dá)到81.8%,結(jié)果表明該方法具有較好的特異性及重復(fù)性,可初步應(yīng)用于HPV的檢測(cè)。
【關(guān)鍵詞】：宮頸癌 宮頸病變 HPV基因型 多重感染 疫苗 雙抗體夾心ELISA
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.33
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 中英文縮略詞表11-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-27
• 1 HPV的分子結(jié)構(gòu)12-13
• 2 HPV分型及各型別的致病性13-16
• 3 HPV基因型的流行狀況16-18
• 4 HPV感染與宮頸癌及癌前病變的關(guān)系18
• 5 HPV多重感染與宮頸病變的關(guān)系18
• 6 宮頸癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素18-20
• 6.1 病毒因素19
• 6.2 宿主因素19-20
• 7 宮頸癌的預(yù)防20-22
• 7.1 宮頸癌的普查20
• 7.2 疫苗預(yù)防20-22
• 8 宮頸癌的檢測(cè)方法22-27
• 8.1 細(xì)胞學(xué)檢查22
• 8.2 感染組織中HPV蛋白的檢測(cè)22
• 8.3 HPV感染的血清學(xué)檢查22-23
• 8.4 HPV檢測(cè)23-24
• 8.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)技術(shù)24-27
• 第二章27-75
• 實(shí)驗(yàn)一 新疆北疆部分地區(qū)HPV的流行狀況27-47
• 1 材料與方法28-36
• 1.1 材料28-31
• 1.2 方法31-36
• 2 結(jié)果36-43
• 2.1 HPV檢出率36-37
• 2.2 宮頸脫落細(xì)胞樣本中HPV感染率37
• 2.3 PCR檢測(cè)結(jié)果37-39
• 2.4 HR-HPV檢測(cè)39-41
• 2.5 多重感染41-43
• 3 討論43-47
• 實(shí)驗(yàn)二 HPV流行基因型L1基因的克隆與分析47-60
• 1 材料與方法48-50
• 1.1 材料48
• 1.2 方法48-50
• 2 結(jié)果50-57
• 2.1 HPV16、58 L1基因的擴(kuò)增50-51
• 2.2 HPV 18、52 L1基因的擴(kuò)增51-52
• 2.3 HPV 53 L1基因的擴(kuò)增52
• 2.4 HPV L1的生物信息分析52-57
• 3 討論57-60
• 實(shí)驗(yàn)三 HPV 16 型單克隆抗體的檢測(cè)以及雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立60-75
• 1 材料及方法61-67
• 1.1 材料61-63
• 1.2 方法63-67
• 2 結(jié)果67-73
• 2.1 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的篩選67-68
• 2.2 雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法建立中各條件的優(yōu)化68-72
• 2.3 雙抗體夾心ELISA方法驗(yàn)證72-73
• 3 討論73-75
• 全文總結(jié)與展望75-77
• 總結(jié)75
• 展望75-77
• 參考文獻(xiàn)77-84
• 附件 184-85
• 附件 285-87
• 附件 387-89
• 致謝89-90
• 作者簡介90-91
• 石河子大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文導(dǎo)師評(píng)閱書91

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本文編號(hào)：839054