本文關鍵詞：新疆北疆部分地區(qū)HPV的分子流行病學調(diào)查及其雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立

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【摘要】：宮頸癌是最常見的女性惡性腫瘤之一,而高危型人乳頭瘤病毒(High-risk human papillomavirus,HR-HPV)的持續(xù)感染與宮頸癌的發(fā)生關系最為密切。目前宮頸癌的發(fā)生率逐漸升高,并呈年強化趨勢發(fā)展,這不僅嚴重影響著婦女的生活質(zhì)量,也給婦女的生命及健康帶來嚴重的威脅。因此明確某一地區(qū)HPV的感染現(xiàn)狀以及流行型別,并了解宮頸病變樣本中HPV的基因變異狀況,這對指導HPV疫苗的應用推廣和新一代疫苗的設計研究以及新的檢測方法的建立具有重要的意義。新疆處于我國西北地區(qū),其宮頸癌的發(fā)生率較高,尤其是在新疆南部少數(shù)民族聚集的區(qū)域,但目前對于新疆北疆地區(qū)HPV的流行狀況以及疫苗還沒有研究。本實驗對新疆北疆部分地區(qū)的HPV的流行狀況以及宮頸病變樣本中HPV基因型的分布以及多重感染與宮頸病變的關系進行了研究。并在此基礎上通過對基因變異情況的分析來研究適合該地區(qū)的HPV疫苗和和建立。研究方法和實驗結果如下:1.新疆北疆部分地區(qū)HPV的流行狀況HPV的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要原因。為了研究新疆北疆部分地區(qū)HPV的流行狀況,和宮頸病變?nèi)巳褐蠬PV基因型的分布,以及多重感染情況。我們收集了2010年1月-2014年12月就診于新疆石河子大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科進行第二代雜交捕獲法(Hybrid Capture 2,HC2)檢測的7298位病人的病例資料,并收集了2014年1月-2014年12月就診病人的宮頸脫落細胞樣本,篩選出經(jīng)病理學診斷有宮頸病變病人的宮頸脫落細胞樣本,并對其進行分子檢測,結果顯示:(1)新疆北疆地區(qū)人乳頭病毒的發(fā)生率仍處于一個較高的水平,其中年齡25歲和≥55歲時出現(xiàn)感染高峰;(2)HR-HPV的檢出率隨著宮頸病變等級的增加而增加,而低危型人乳頭瘤病毒的感染率(Low-risk human papillomavirus,LR-HPV)隨宮頸病變程度的變化而變化不大;(3)在新疆北疆部分地區(qū)至少存在29種HPV基因型,其中HR-HPV 17種,LR-HPV 12種,其中發(fā)生率較高的HR-HPV基因型依次為HPV 16、53、52、58、35;(4)在多重感染檢測中,主要以二重感染為主,其中以HPV 16型的合并感染最為常見,還出現(xiàn)了三重、四重、五重、六重感染,并且多重感染與宮頸病變的嚴重程度無關。2.HPV流行基因型L1基因的克隆與分析為了研究新疆北疆地區(qū)流行的主要HR-HPV L1基因的變異情況,設計了能夠擴增HPV 16、52、53、58以及在世界范圍內(nèi)發(fā)生率較高且致癌性較強的HPV 18型的L1全長序列的引物,并經(jīng)過測序、拼接、比對后獲得L1基因序列全長。通過與現(xiàn)有的疫苗株和美國株序列進行比對后發(fā)現(xiàn),在核酸水平上均發(fā)生了突變,有些堿基突變甚至導致了氨基酸的改變。以HPV 16 L1基因為例,對新疆株與疫苗株進行分子生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)兩者之間存在差異。這為新疆北疆地區(qū)疫苗的引進以及多價疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)。同時本章還參照以往報道,篩選出保守性較好的多肽片段,為下一章節(jié)單克隆抗體的制備奠定基礎。3.HPV 16型單克隆抗體的檢測以及雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立為了建立適合新疆北疆地區(qū)自身發(fā)展特點的HPV檢測方法,本研究在實驗二的篩選得出的保守片段基礎上,對多肽片段進行合成,并進行KLH偶聯(lián),然后免疫小鼠,最終獲得15株含有單克隆抗體的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清,Western blot檢測后,篩選出兩株特異性較好的細胞株,并對其進行純化,其中一株純化的單抗進行辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)標記后作為檢測抗體,另一株純化單抗作為捕獲抗體,以此為基礎建立檢測HPV的雙抗體夾心ELISA法。通過對抗體稀釋液等條件進行優(yōu)化,確定捕獲抗體的最佳濃度為1.69μg/m L,檢測抗體的工作效價為1:100,樣品反應時間為45 min;酶標抗體作用時間為40 min;顯色時間為15 min,用建立的雙抗體夾心ELISA方法與TS-PCR(Type-Specific Polymerase Chain Reaction,TS-PCR)方法同時檢測66份臨床宮頸脫落細胞樣本,符合率達到81.8%,結果表明該方法具有較好的特異性及重復性,可初步應用于HPV的檢測。
【關鍵詞】：宮頸癌 宮頸病變 HPV基因型 多重感染 疫苗 雙抗體夾心ELISA
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 中英文縮略詞表11-12
• 第一章 文獻綜述12-27
• 1 HPV的分子結構12-13
• 2 HPV分型及各型別的致病性13-16
• 3 HPV基因型的流行狀況16-18
• 4 HPV感染與宮頸癌及癌前病變的關系18
• 5 HPV多重感染與宮頸病變的關系18
• 6 宮頸癌發(fā)生的危險因素18-20
• 6.1 病毒因素19
• 6.2 宿主因素19-20
• 7 宮頸癌的預防20-22
• 7.1 宮頸癌的普查20
• 7.2 疫苗預防20-22
• 8 宮頸癌的檢測方法22-27
• 8.1 細胞學檢查22
• 8.2 感染組織中HPV蛋白的檢測22
• 8.3 HPV感染的血清學檢查22-23
• 8.4 HPV檢測23-24
• 8.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗技術24-27
• 第二章27-75
• 實驗一 新疆北疆部分地區(qū)HPV的流行狀況27-47
• 1 材料與方法28-36
• 1.1 材料28-31
• 1.2 方法31-36
• 2 結果36-43
• 2.1 HPV檢出率36-37
• 2.2 宮頸脫落細胞樣本中HPV感染率37
• 2.3 PCR檢測結果37-39
• 2.4 HR-HPV檢測39-41
• 2.5 多重感染41-43
• 3 討論43-47
• 實驗二 HPV流行基因型L1基因的克隆與分析47-60
• 1 材料與方法48-50
• 1.1 材料48
• 1.2 方法48-50
• 2 結果50-57
• 2.1 HPV16、58 L1基因的擴增50-51
• 2.2 HPV 18、52 L1基因的擴增51-52
• 2.3 HPV 53 L1基因的擴增52
• 2.4 HPV L1的生物信息分析52-57
• 3 討論57-60
• 實驗三 HPV 16 型單克隆抗體的檢測以及雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立60-75
• 1 材料及方法61-67
• 1.1 材料61-63
• 1.2 方法63-67
• 2 結果67-73
• 2.1 雜交瘤細胞培養(yǎng)上清的篩選67-68
• 2.2 雙抗體夾心ELISA檢測方法建立中各條件的優(yōu)化68-72
• 2.3 雙抗體夾心ELISA方法驗證72-73
• 3 討論73-75
• 全文總結與展望75-77
• 總結75
• 展望75-77
• 參考文獻77-84
• 附件 184-85
• 附件 285-87
• 附件 387-89
• 致謝89-90
• 作者簡介90-91
• 石河子大學碩士研究生學位論文導師評閱書91

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本文編號：839054