發(fā)布時間：2017-09-12 12:32

  本文關鍵詞：髓源抑制性細胞對結直腸癌發(fā)生發(fā)展的影響及機制初探

  更多相關文章： 腫瘤微環(huán)境 髓源抑制性細胞 結直腸癌 促炎因子 巨噬細胞

【摘要】：研究背景及目的：結直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是全球第三大常見腫瘤,近年來,由于生活方式的改變,發(fā)展中國家的結直腸癌發(fā)病率呈逐年升高趨勢,成為危害公眾健康的重大疾病之一。每年新診斷的結直腸癌患者超過130萬,每年因結直腸癌導致死亡的則超過60萬人。CRC的平均5年生存率為65.0%,但因分期不同而差異較大,大約20%的結直腸癌患者診斷明確時已存在轉移,這部分患者的中位生存時間一般小于2年。過去幾年,針對結直腸癌的治療方式如手術、化療、分子靶向治療(如抗EGFR(西妥昔單抗)和VEGF(貝伐單抗))等均取得了快速發(fā)展[4-7]。這些治療方法均在一定程度上降低了結直腸癌的死亡率,但由于結直腸癌的原位復發(fā)和遠隔轉移,目前針對mCRC的治療遠沒有達到臨床預期的效果。近年來,一種具有免疫抑制功能的細胞-MDSCs(myeloid-derived suppressor cells髓源抑制性細胞)得到廣泛的研究,MDSCs是未成熟的異質性髓系細胞,在腫瘤患者和動物模型中,MDSCs可以募集到腫瘤微環(huán)境、淋巴結、脾臟及外周血中,具有抑制先天和后天抗腫瘤免疫功能。MDSCs是腫瘤免疫抑制最重要的調控者之一,不僅顯著抑制T細胞介導的抗腫瘤免疫,還可通過促進腫瘤血管生成和建立適宜腫瘤轉移的微環(huán)境等直接促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移。在荷瘤小鼠中,MDSCs的表型確定為CDllb+ Gr-1+,根據Gr-1的兩個亞型：Ly6G和Ly6C,以及另一表面標記CD49d,可將CD11b+Gr-1+MDSCs進一步分為粒系MDSCs(G-MDSCs)CD11b+Gr-1hi Ly-6Clow Ly-6G+CD49d-和單核系MDSCs(Mo-MDSCs) CD11b+Gr-1intLy-6Chi Ly-6G-CD49d+。在結直腸癌患者中,通常將MDSCs表型定義為CD11b+CD33+HLA-DR-, MDSCs在Ⅲ和Ⅳ期結直腸癌患者外周血中水平顯著高于健康對照、Ⅰ和Ⅱ期結直腸癌患者,并和腫瘤的轉移具有相關性,此外,外周循環(huán)中的MDSCs水平和血清中VEGF水平也具有相關性。在慢性炎癥-結直腸腫瘤動物模型中,研究者發(fā)現通過抑制MDSCs的在腸黏膜的局部浸潤可抑制腫瘤的形成。盡管如此,目前有關MDSCs直接促進結直腸癌發(fā)生發(fā)展的機制研究甚少,MDSCs在結直腸癌腫瘤微環(huán)境中和結直腸腫瘤的相互作用目前仍不清楚,MDSCs作為一種不成熟的細胞類型,其在腫瘤微環(huán)境中的分化等問題均沒有得到闡釋。闡明上述問題對于進一步了解MDSCs在腫瘤尤其是結直腸癌中的作用,指導未來腫瘤免疫治療新方法具有重要意義。目的：為更好地了解腫瘤微環(huán)境中MDSCs(髓源抑制性細胞)對結直腸癌發(fā)生發(fā)展的影響,進一步明確MDSCs(髓源抑制性細胞)和結直腸癌細胞之間相互作用的機制,探索腫瘤微環(huán)境中的MDSCs的分化情況,為以MDSCs為靶點,全面摧毀腫瘤微環(huán)境的腫瘤治療新方案提供更多依據。方法1、MDSCs在初診結直腸癌患者及不同結直腸癌模型中的募集表達情況1.1：新診斷的結直腸癌患者外周血中MDSCs的比例情況分析。收集2012年3月1日至2012年8月1日期間南方醫(yī)院初診大腸癌患者42例(平均年齡57.8歲,28-84；男27例,女15例)及健康正常對照19例肝素抗凝靜脈血6.0ml,密度梯度離心法提取PBMC,流式細胞技術檢測MDSCs (CD11b+CD33+HLA-DR-)細胞比例。1.2：荷瘤小鼠外周血、脾臟、骨髓、腫瘤原位的MDSCs(CD11b+Gr-1+)募集情況分析。應用CT-26結腸癌細胞構建小鼠皮下移植瘤模型,制備外周血PBM C、脾臟、骨髓、腫瘤原位的單細胞懸液,流式細胞術檢測其中MDSCs(CD11b+Gr-1+)細胞分布及比例情況；免疫組化檢測Gr-1在腫瘤組織中的表達情況。1.3：AOM+DSS誘導的炎癥相關結直腸癌模型外周血、脾臟、骨髓中MDSCs (CD11b+Gr-1+)的分布特點。成功構建AOM+DSS誘導的炎癥相關結直腸癌模型,行常規(guī)組織病理學檢測加以驗證,評價MDSCs在不同誘導階段的不同部位的募集情況。2、MDSCs與結直腸癌細胞之間的相互作用2.1:MDSCs對結直腸癌細胞的遷移侵襲能力的影響。采用流式分選技術分選MDSCs,體外與腸癌細胞共培養(yǎng),應用劃痕愈合實驗、transwell侵襲小室實驗探討MDSCs對腸癌細胞遷移和侵襲能力的影響。2.2：HT-29細胞和MDSCs細胞之間的相互作用對促炎因子分泌的影響。應用蛋白質芯片檢測技術檢測HT-29細胞與MDSCs(CD11b+CD33+HLA-DR-)細胞共培養(yǎng)上清中促炎因子的表達情況。2.3：腫瘤微環(huán)境對MDSCs分化的影響。免疫磁珠分選技術分選荷瘤小鼠脾臟MDSCs(CD11b+Gr-1+),將MDSCs在腫瘤微環(huán)境中連續(xù)培養(yǎng)5天,用流式細胞術檢測巨噬細胞表面標記(F4/80：巨噬細胞總群標記,MHCII:M1型巨噬細胞標記,CD206:M2型巨噬細胞)變化情況。3、統(tǒng)計學方法：流式細胞結果先行方差齊性檢驗,方差齊(P0.05)則行兩獨立樣本t檢驗,IHC切片隨機選取3-5個不同視野,評估目的蛋白的陽性表達情況。應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析,所有數據采用均數±標準差(x±SD)表示,P0.05具有顯著性差異。結果：1、MDSCs在初診結直腸癌患者外周血、不同結直腸癌模型中水平顯著高于正常對照組1.1新診斷的結直腸癌患者外周血中MDSCs (CD11b+CD33+HLA-DR)水平明顯高于正常對照組。1.2在荷瘤小鼠的外周血、脾臟、骨髓、腫瘤原位中浸潤的MDSCs水平明顯高于正常對照組。1.3 MDSC s在AOM+DSS炎癥-腫瘤相關模型外周血、脾臟、骨髓中的含量與造模時間有明顯相關性,并且隨著時間的增加呈上升趨勢。2、MDSCs與腸癌細胞相互作用改變腫瘤微環(huán)境中促炎因子表達水平,促進腫瘤進展及MDSCs分化。2.1 MDSCs與腸癌細胞的共培養(yǎng)上清可明顯促進腸癌細胞的遷移能力。2.2 MDSCs可明顯促進腸癌細胞的侵襲能力。2.3 MDSCs和HT-29細胞共培養(yǎng)后可明顯促進炎性因子的表達。2.4 MDSCs在體外腫瘤微環(huán)境中可分化為M2型巨噬細胞。結論1、MDSCs水平在初診結直腸癌患者外周血,荷瘤小鼠和炎癥-腫瘤模型小鼠的外周血、脾臟、骨髓及腫瘤原位中顯著升高。2、MDSCs細胞和結直腸癌細胞相互作用產生大量的促炎因子促進結直腸癌細胞的遷移侵襲。3、MDSCs在腫瘤微環(huán)境中可分化為M2型巨噬細胞。本研究的創(chuàng)新之處1、首次系統(tǒng)探討了MDSCs在新診斷結直腸癌患者外周血、小鼠結直腸癌皮下移植瘤模型、AOM+DSs誘導的炎癥-腫瘤相關模型中不同部位(外周血、脾臟、骨髓、腫瘤原位中)募集情況。2、采用蛋白芯片技術篩選出了MDSCs與HT-29結腸癌細胞相互作用后高表達的促炎因子。3、提出MDSCs在結直腸腫瘤微環(huán)境中可繼續(xù)分化為M2型巨噬細胞促進腫瘤進展的新觀點。
【關鍵詞】：腫瘤微環(huán)境 髓源抑制性細胞 結直腸癌 促炎因子 巨噬細胞
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-29
• 第一章 MDSCS在初診結直腸癌患者外周血、不同結直腸癌模型中的募集表達情況29-43
• 1. 新診斷的結直腸癌患者外周血中MDSCs(CD11B~+CD33~+HLA-DR~-29-33
• 1.1 實驗材料29
• 1..2 統(tǒng)計學分析29-30
• 1.3 實驗步驟30-31
• 1..4 結果31-33
• 2. 荷瘤小鼠外周血,脾臟、骨髓、腫瘤原位的MDSCs(CD11B+GR-1+)募集情況分析33-38
• 2.1. 實驗材料33
• 2.2 統(tǒng)汁學分析33
• 2.3 實驗步驟33-35
• 2.4 結果35-38
• 3 AOM+DSS誘導的炎癥相關的結腸癌模型外周血、脾臟、骨髓中MDSCs(CD11B~+GR-1~+)的分布特點38-43
• 3.1 實驗材料38
• 3.2 實驗步驟38-39
• 3.3 結果39-43
• 第二章 MDSCS與結直腸癌細胞之間的相互作用及機制初探43-56
• 1. MDSCs對結直腸癌細胞的侵襲轉移能力的影響43-47
• 1.1 實驗材料43
• 1.2 統(tǒng)計學方法43-44
• 1.3 實驗步驟44-45
• 1.4 結果45-47
• 2. HT-29細胞和MDSCs(CD11B~+CD33~+HLA-DR~-)細胞之間的相互作用對促炎因子表達的影響47-51
• 2.1 材料試劑48
• 2.2. 實驗步驟48-49
• 2.3 結果49-51
• 3. 腫瘤微環(huán)境可促進MDSCs分化的影響51-56
• 3.1 實驗材料52
• 3.2 統(tǒng)計學方法52
• 3.3 實驗步驟52-53
• 3.4 結果53-56
• 討論56-60
• 全文小結60-62
• 參考文獻62-78
• 中英文對照縮略詞表78-80
• 致謝80-81
• 成果81-82

【共引文獻】

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