本文關鍵詞：KRAB型鋅指蛋白PITA和PISA轉基因小鼠表型分析及SUMO化修飾的Apak對核糖體RNA合成調控的研究

  更多相關文章： 細胞代謝 p53 KRAB 型鋅指蛋白 糖酵解 線粒體氧化磷酸化 Apak SUMO 化修飾 核糖體 RNA

【摘要】：p53作為重要的轉錄因子,響應多種細胞信號的應激,從而調控下游不同的靶基因維持細胞的穩(wěn)定。以往的研究主要關注p53對細胞周期阻滯和凋亡的調控,近年來p53相關代謝的靶基因的研究成為熱點,研究表明p53可以通過轉錄激活下游靶基因TIGAR和SCO2的表達抑制糖酵解,促進氧化磷酸化。隨著對p53參與代謝調控研究的深入,p53的上游分子如何參與代謝靶基因的選擇性調控,從而最終決定細胞的命運成為研究的新方向。在哺乳動物中KRAB型鋅指蛋白分子(KZNF)組成了最大的轉錄調控因子家族,大量的研究發(fā)現(xiàn)KZNF蛋白表現(xiàn)出轉錄抑制效應,參與細胞的增殖、凋亡及代謝等調控過程。Apak(ATM and p53 associated KZNF protein)是實驗室前期在該家族中鑒定到新的p53負調控因子,能夠選擇性調控p53相關的凋亡靶基因的表達,而對細胞周期阻滯沒有明顯影響。KZNF家族分子功能結構域比較保守,那么該家族是否還有其它分子參與p53介導的代謝相關靶基因的選擇性調控,目前尚無報道。分子實驗研究發(fā)現(xiàn),KZNF蛋白家族中兩個分子KZNF475和KZNF568能夠抑制p53的轉錄活性,且能夠與p53結合;KZNF475特異性抑制p53下游靶基因TIGAR的表達,因此將其命名為PITA(p53 inhibitor on TIGAR activation),KZNF568特異性抑制p53下游靶基因SCO2的表達,因此將其命名為PISA(p53inhibitor on SCO2 activation)。TIGAR抑制糖酵解中的限速酶磷酸果糖激酶1(PFK1)的活性抑制糖酵解并促進磷酸戊糖旁路途經(jīng);SCO2促進細胞色素c氧化酶復合體的組裝并對酶活性有重要的調控作用。在細胞學水平檢測發(fā)現(xiàn)PITA選擇性的抑制TIGAR的表達,促進細胞糖酵解進程;PISA選擇性的抑制p53對SCO2的轉錄激活,從而抑制氧化磷酸化。p53感應不同程度的應激從而做出相應的細胞學反應,當在輕微的損傷應激下PITA解除了對p53的抑制,促進細胞的修復存活。在嚴重損傷應激下,PISA與p53發(fā)生解離,使得p53下游的SCO2被激活,誘發(fā)細胞的死亡。本研究首先成功構建了PITA、PISA轉基因小鼠模型,并利用該模型從動物體內水平進一步驗證PITA與PISA對糖酵解通路及線粒體氧化磷酸化通路的調控。研究發(fā)現(xiàn)PITA轉基因小鼠骨骼肌組織中PFK1的活性較野生型小鼠明顯升高,葡萄糖的消耗以及乳酸的生成增加,表明小鼠體內糖酵解速率增強;進一步檢測發(fā)現(xiàn)PITA轉基因小鼠體內NADPH的水平降低,表明小鼠體內還原力降低;PITA轉基因小鼠整體代謝水平低于野生型小鼠。與野生型小鼠比較發(fā)現(xiàn)PISA轉基因小鼠骨骼肌組織和腎臟中細胞色素C氧化酶活性降低,能量的代謝傾向于通過糖酵解途經(jīng);PISA轉基因小鼠的整體代謝水平低于野生型小鼠。當p53缺失時,ATP的產生的主要方式轉變?yōu)樘墙徒舛钦５难趸姿峄窘?jīng),這一現(xiàn)象在腫瘤細胞中稱為Warburg效應。對能量代謝的調控是p53發(fā)揮抑制腫瘤的重要功能。通過多器官癌的篩選發(fā)現(xiàn),PITA、PISA在食管癌、胃癌、結直腸癌、肝癌、乳腺癌和肺癌中都有較高的表達,其中結直腸組織的癌和癌旁表達差異最為明顯,通過75例結直腸癌臨床樣本分析表明PITA、PISA的表達癌高于癌旁,具有顯著性差異。綜上,本研究首次建立PITA和PISA轉基因小鼠模型,獲得了關于PITA和PISA基因生理功能的證據(jù),發(fā)現(xiàn)了PITA和PISA分別在糖酵解通路和線粒體氧化磷酸化通路中發(fā)揮重要的選擇性調控功能,并且初步探討了PITA和PISA與結直腸癌的相關性。核糖體是由核糖體RNA和核糖體蛋白組成的復合體,其功能是參與蛋白質合成。SUMO化修飾對底物蛋白的定位及活性有重要的調控作用,前期研究發(fā)現(xiàn)在核仁應激下ARF促進Apak發(fā)生SUMO化修飾并使其入核仁。為了進一步探討SUMO化修飾的KRAB型鋅指蛋白Apak對核糖體RNA合成的調控功能,本研究通過Northern Blot檢測SUMO化修飾的Apak對核糖體RNA合成的影響;通過運用實時定量PCR檢測SUMO化修飾的Apak對核糖體RNA轉錄水平的調控;采用RNA-Ch IP方法檢測核糖體RNA與Apak蛋白的相互作用,結果表明:SUMO化修飾的Apak抑制47S核糖體RNA前體的合成,主要抑制RNA聚合酶Ⅰ介導轉錄的18S和5.8S r RNA,另外在放線菌素D以及原癌基因Ras V12激活條件誘導下促進Apak與18S、5.8S核糖體RNA相互作用。本次研究為理解Apak的功能和作用機制提供了新的依據(jù),為深入研究KRAB型鋅指蛋白家族分子功能奠定了基礎。
【關鍵詞】：細胞代謝 p53 KRAB 型鋅指蛋白 糖酵解 線粒體氧化磷酸化 Apak SUMO 化修飾 核糖體 RNA
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2
【目錄】：

• 縮略語5-6
• 第一部分KRAB型鋅指蛋白PITA和PISA轉基因小鼠表型分析6-38
• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-15
• 實驗材料15-18
• 實驗方法18-24
• 實驗結果24-35
• 討論35-38
• 第二部分SUMO化修飾的Apak對核糖體RNA合成的調控作用38-46
• 中文摘要38-39
• Abstract39-40
• 前言40
• 實驗材料40-41
• 實驗方法41-42
• 實驗結果42-46
• 討論46
• 結論46-47
• 參考文獻47-55
• 附錄55-56
• 致謝56-58
• 綜述58-70
• 參考文獻64-70

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