本文關(guān)鍵詞：KRAB型鋅指蛋白PITA和PISA轉(zhuǎn)基因小鼠表型分析及SUMO化修飾的Apak對(duì)核糖體RNA合成調(diào)控的研究

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【摘要】：p53作為重要的轉(zhuǎn)錄因子,響應(yīng)多種細(xì)胞信號(hào)的應(yīng)激,從而調(diào)控下游不同的靶基因維持細(xì)胞的穩(wěn)定。以往的研究主要關(guān)注p53對(duì)細(xì)胞周期阻滯和凋亡的調(diào)控,近年來(lái)p53相關(guān)代謝的靶基因的研究成為熱點(diǎn),研究表明p53可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活下游靶基因TIGAR和SCO2的表達(dá)抑制糖酵解,促進(jìn)氧化磷酸化。隨著對(duì)p53參與代謝調(diào)控研究的深入,p53的上游分子如何參與代謝靶基因的選擇性調(diào)控,從而最終決定細(xì)胞的命運(yùn)成為研究的新方向。在哺乳動(dòng)物中KRAB型鋅指蛋白分子(KZNF)組成了最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族,大量的研究發(fā)現(xiàn)KZNF蛋白表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄抑制效應(yīng),參與細(xì)胞的增殖、凋亡及代謝等調(diào)控過(guò)程。Apak(ATM and p53 associated KZNF protein)是實(shí)驗(yàn)室前期在該家族中鑒定到新的p53負(fù)調(diào)控因子,能夠選擇性調(diào)控p53相關(guān)的凋亡靶基因的表達(dá),而對(duì)細(xì)胞周期阻滯沒(méi)有明顯影響。KZNF家族分子功能結(jié)構(gòu)域比較保守,那么該家族是否還有其它分子參與p53介導(dǎo)的代謝相關(guān)靶基因的選擇性調(diào)控,目前尚無(wú)報(bào)道。分子實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),KZNF蛋白家族中兩個(gè)分子KZNF475和KZNF568能夠抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性,且能夠與p53結(jié)合;KZNF475特異性抑制p53下游靶基因TIGAR的表達(dá),因此將其命名為PITA(p53 inhibitor on TIGAR activation),KZNF568特異性抑制p53下游靶基因SCO2的表達(dá),因此將其命名為PISA(p53inhibitor on SCO2 activation)。TIGAR抑制糖酵解中的限速酶磷酸果糖激酶1(PFK1)的活性抑制糖酵解并促進(jìn)磷酸戊糖旁路途經(jīng);SCO2促進(jìn)細(xì)胞色素c氧化酶復(fù)合體的組裝并對(duì)酶活性有重要的調(diào)控作用。在細(xì)胞學(xué)水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PITA選擇性的抑制TIGAR的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞糖酵解進(jìn)程;PISA選擇性的抑制p53對(duì)SCO2的轉(zhuǎn)錄激活,從而抑制氧化磷酸化。p53感應(yīng)不同程度的應(yīng)激從而做出相應(yīng)的細(xì)胞學(xué)反應(yīng),當(dāng)在輕微的損傷應(yīng)激下PITA解除了對(duì)p53的抑制,促進(jìn)細(xì)胞的修復(fù)存活。在嚴(yán)重?fù)p傷應(yīng)激下,PISA與p53發(fā)生解離,使得p53下游的SCO2被激活,誘發(fā)細(xì)胞的死亡。本研究首先成功構(gòu)建了PITA、PISA轉(zhuǎn)基因小鼠模型,并利用該模型從動(dòng)物體內(nèi)水平進(jìn)一步驗(yàn)證PITA與PISA對(duì)糖酵解通路及線粒體氧化磷酸化通路的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)PITA轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌組織中PFK1的活性較野生型小鼠明顯升高,葡萄糖的消耗以及乳酸的生成增加,表明小鼠體內(nèi)糖酵解速率增強(qiáng);進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PITA轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)NADPH的水平降低,表明小鼠體內(nèi)還原力降低;PITA轉(zhuǎn)基因小鼠整體代謝水平低于野生型小鼠。與野生型小鼠比較發(fā)現(xiàn)PISA轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌組織和腎臟中細(xì)胞色素C氧化酶活性降低,能量的代謝傾向于通過(guò)糖酵解途經(jīng);PISA轉(zhuǎn)基因小鼠的整體代謝水平低于野生型小鼠。當(dāng)p53缺失時(shí),ATP的產(chǎn)生的主要方式轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒舛钦５难趸姿峄窘?jīng),這一現(xiàn)象在腫瘤細(xì)胞中稱(chēng)為Warburg效應(yīng)。對(duì)能量代謝的調(diào)控是p53發(fā)揮抑制腫瘤的重要功能。通過(guò)多器官癌的篩選發(fā)現(xiàn),PITA、PISA在食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌和肺癌中都有較高的表達(dá),其中結(jié)直腸組織的癌和癌旁表達(dá)差異最為明顯,通過(guò)75例結(jié)直腸癌臨床樣本分析表明PITA、PISA的表達(dá)癌高于癌旁,具有顯著性差異。綜上,本研究首次建立PITA和PISA轉(zhuǎn)基因小鼠模型,獲得了關(guān)于PITA和PISA基因生理功能的證據(jù),發(fā)現(xiàn)了PITA和PISA分別在糖酵解通路和線粒體氧化磷酸化通路中發(fā)揮重要的選擇性調(diào)控功能,并且初步探討了PITA和PISA與結(jié)直腸癌的相關(guān)性。核糖體是由核糖體RNA和核糖體蛋白組成的復(fù)合體,其功能是參與蛋白質(zhì)合成。SUMO化修飾對(duì)底物蛋白的定位及活性有重要的調(diào)控作用,前期研究發(fā)現(xiàn)在核仁應(yīng)激下ARF促進(jìn)Apak發(fā)生SUMO化修飾并使其入核仁。為了進(jìn)一步探討SUMO化修飾的KRAB型鋅指蛋白Apak對(duì)核糖體RNA合成的調(diào)控功能,本研究通過(guò)Northern Blot檢測(cè)SUMO化修飾的Apak對(duì)核糖體RNA合成的影響;通過(guò)運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SUMO化修飾的Apak對(duì)核糖體RNA轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控;采用RNA-Ch IP方法檢測(cè)核糖體RNA與Apak蛋白的相互作用,結(jié)果表明:SUMO化修飾的Apak抑制47S核糖體RNA前體的合成,主要抑制RNA聚合酶Ⅰ介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的18S和5.8S r RNA,另外在放線菌素D以及原癌基因Ras V12激活條件誘導(dǎo)下促進(jìn)Apak與18S、5.8S核糖體RNA相互作用。本次研究為理解Apak的功能和作用機(jī)制提供了新的依據(jù),為深入研究KRAB型鋅指蛋白家族分子功能奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)胞代謝 p53 KRAB 型鋅指蛋白 糖酵解 線粒體氧化磷酸化 Apak SUMO 化修飾 核糖體 RNA
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R730.2
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)5-6
• 第一部分KRAB型鋅指蛋白PITA和PISA轉(zhuǎn)基因小鼠表型分析6-38
• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-15
• 實(shí)驗(yàn)材料15-18
• 實(shí)驗(yàn)方法18-24
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-35
• 討論35-38
• 第二部分SUMO化修飾的Apak對(duì)核糖體RNA合成的調(diào)控作用38-46
• 中文摘要38-39
• Abstract39-40
• 前言40
• 實(shí)驗(yàn)材料40-41
• 實(shí)驗(yàn)方法41-42
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-46
• 討論46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-55
• 附錄55-56
• 致謝56-58
• 綜述58-70
• 參考文獻(xiàn)64-70

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本文編號(hào)：825334