本文關(guān)鍵詞：人結(jié)腸癌細(xì)胞GOLPH3基因與Wnt信號通路的相關(guān)性研究

  更多相關(guān)文章： 人結(jié)腸癌細(xì)胞株 GOLPH3 Wnt信號通路 Akt GSK-3β β-catenin

【摘要】：目的:結(jié)直腸癌組織中GOLPH3過表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖,其機(jī)制與激活PI3K/Akt/m TOR信號通路相關(guān),本實(shí)驗(yàn)通過對GOLPH3基因與Wnt信號通路活性的相關(guān)性進(jìn)行研究,探討GOLPH3基因過表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的相關(guān)機(jī)制。方法:1、RT-PCR檢測HCT116、HT29、SW480及SW620四種人結(jié)腸癌細(xì)胞中GOLPH3 m RNA的表達(dá)情況,選擇表達(dá)水平最高的人結(jié)腸癌細(xì)胞株繼續(xù)進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。2、將人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞株分為四個(gè)組:對照組、si RNA-GOLPH3轉(zhuǎn)染組、加Akt抑制劑Tricinbine組及加GSK-3β抑制劑TWS119組。3、RT-PCR方法檢測結(jié)腸癌SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染si RNA-GOLPH3后的沉默效果。4、通過Topflash報(bào)告基因活性檢測各組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞Wnt信號通路的活性。5、應(yīng)用MTT法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測各組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的增殖情況。6、利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的凋亡率。7、Western Blot檢測各組結(jié)腸癌細(xì)胞中GOLPH3、β-catenin、GSK-3β、p S9-GSK-3β蛋白的表達(dá)。8、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果,探討GOLPH3基因過表達(dá)通過激活Wnt信號通路促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的相關(guān)性。結(jié)果:1、RT-PCR法檢測四種人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、HT29、SW480及SW620中GOLPH3 m RNA的表達(dá)水平(1.00±0.097)、(2.872±0.064)、(1.957±0.133)與(3.958±0.169)。GOLPH3 m RNA在結(jié)腸癌SW620細(xì)胞株中表達(dá)水平最高,選擇人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620進(jìn)行后續(xù)的分組實(shí)驗(yàn)。2、人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞GOLPH3 m RNA的表達(dá)水平分別為(1.000±0.092)和(0.236±0.076),轉(zhuǎn)染組表達(dá)水平顯著性低于對照組(P0.001),轉(zhuǎn)染效果良好。3、對照組與三個(gè)實(shí)驗(yàn)組(si RNA-GOLPH3;加Tricinbine;加TWS119)SW620癌細(xì)胞的相對熒光素酶活性(Relative Luciferase Activity),即相對RLU值分別為(1.000±0.164)與(0.342±0.061)、(0.359±0.125)、(0.365±0.155),三個(gè)實(shí)驗(yàn)組癌細(xì)胞的相對RLU值均明顯低于對照組(P0.01),并且各實(shí)驗(yàn)組間相互對比,癌細(xì)胞的RLU值無顯著差別(P0.05)。4、MTT法檢測對照組與三個(gè)實(shí)驗(yàn)組(si RNA-GOLPH3;加Tricinbine;加TWS119)癌細(xì)胞的生長抑制率分別為0與59.9%、56.6%、51.3%,各實(shí)驗(yàn)組癌細(xì)胞的生長抑制率均高于對照組(P0.05),同時(shí)各實(shí)驗(yàn)組間互相對比,癌細(xì)胞的生長抑制情況無明顯差異(P0.05)。5、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測對照組及三個(gè)實(shí)驗(yàn)組(si RNA-GOLPH3;加Tricinbine;加TWS119)SW620癌細(xì)胞的集落數(shù)分別為(207.333±17.786)、(82.333±15.144)、(93.333±12.342)、(95.667±16.563),各實(shí)驗(yàn)組癌細(xì)胞集落數(shù)均顯著低于對照組(P0.001),在各實(shí)驗(yàn)組間的比較顯示癌細(xì)胞的克隆能力無差異性(P0.05)。6、對照組與三個(gè)實(shí)驗(yàn)組(si RNA-GOLPH3;加Tricinbine;加TWS119)SW620癌細(xì)胞的凋亡率分別為(1.680±0.576)%與(52.467±4.373)%、(46.167±5.293)%、(50.167±6.506)%,實(shí)驗(yàn)組癌細(xì)胞的凋亡比例均顯著性增加(P0.001),且各實(shí)驗(yàn)組間互相比較顯示癌細(xì)胞的凋亡情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7、Western Blot檢測結(jié)果:與對照組比較:①在si RNA-GOLPH3組:癌細(xì)胞GOLPH3蛋白表達(dá)明顯下降(P0.001),β-catenin蛋白表達(dá)明顯降低(P0.001),GSK-3β蛋白表達(dá)無差別(P0.05),p S9-GSK3β蛋白表達(dá)明顯降低(P0.001);②加Tricinbine組:GOLPH3蛋白表達(dá)無差異(P0.05),β-catenin蛋白表達(dá)明顯降低(P0.001),GSK-3β蛋白表達(dá)無差異(P0.05),p S9-GSK3β蛋白表達(dá)明顯降低(P0.001);③加TWS119組:GOLPH3蛋白表達(dá)無差別(P0.05),β-catenin蛋白表達(dá)顯著降低(P0.001),GSK-3β蛋白表達(dá)無差異(P0.05),p S9-GSK3β蛋白表達(dá)顯著下降(P0.001)。各實(shí)驗(yàn)組比較:①GOLPH3蛋白的表達(dá)在si RNA-GOLPH3組低于加Tricinbine組及加TWS119組(P0.05),并且后兩組間表達(dá)無差異性(P0.05);②在si RNA-GOLPH3組及加Tricinbine組中β-catenin蛋白的表達(dá)無差別(P0.05),但均低于加TWS119組的表達(dá)(P0.05);③GSK-3β蛋白及p S9-GSK3β蛋白在各實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1、GOLPH3基因過表達(dá)可激活Wnt信號通路,上調(diào)β-catenin表達(dá),促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖,抑制凋亡;2、Akt、GSK3β活化可開啟Wnt信號通路,上調(diào)β-catenin表達(dá),促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖,抑制凋亡;3、GOLPH3基因過表達(dá)可激活Wnt信號通路,其機(jī)制是GOLPH3過表達(dá)可激活A(yù)kt,并進(jìn)一步通過GSK3β介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Wnt信號通路的激活,促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。
【關(guān)鍵詞】：人結(jié)腸癌細(xì)胞株 GOLPH3 Wnt信號通路 Akt GSK-3β β-catenin
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-15
• 材料和方法15-26
• 1. 材料15-17
• 1.1 細(xì)胞株15
• 1.2 主要試劑15-16
• 1.3 主要儀器16-17
• 1.4 主要溶劑的配置17
• 2. 方法17-26
• 2.1 RT-PCR 方法檢測四種人結(jié)腸癌細(xì)胞中 GOLPH3 m RNA 的表達(dá)，，選擇高表達(dá)的癌細(xì)胞株分組實(shí)驗(yàn)17-20
• 2.2 篩選、分組20-21
• 2.3 Wnt信號通路活性的測定21
• 2.4 MTT法檢測各組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的增殖21-22
• 2.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)22
• 2.6 流式細(xì)胞儀檢測各組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的凋亡22-23
• 2.7 Western Blot 檢測各組 SW620 結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi) GOLPH3、β-catenin、GSK-3β、p S9-GSK3β蛋白的表達(dá)23-25
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析25-26
• 結(jié)果26-34
• 1. GOLPH3 m RNA在四種人結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)26
• 2. 結(jié)腸癌SW620細(xì)胞si RNA轉(zhuǎn)染26-27
• 3. 各實(shí)驗(yàn)組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞Wnt信號通路活性的檢測27-28
• 4. 各實(shí)驗(yàn)組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖能力的檢測28-29
• 5. 各實(shí)驗(yàn)組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的克隆情況29-30
• 6. 各實(shí)驗(yàn)組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的凋亡率30-32
• 7. 各組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞GOLPH3、β-catenin、GSK-3β及p S9-GSK3β蛋白的表達(dá)32-34
• 討論34-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-45
• 綜述45-64
• 參考文獻(xiàn)55-64
• 致謝64

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本文編號：823531