乙型肝炎病毒X基因亞型EHBH2在原發(fā)性肝癌進(jìn)程中的作用及臨床意義研究

發(fā)布時(shí)間：2017-09-09 06:11

本文關(guān)鍵詞：乙型肝炎病毒X基因亞型EHBH2在原發(fā)性肝癌進(jìn)程中的作用及臨床意義研究

【摘要】：在消化系統(tǒng)疾病中,原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是肝臟疾病中嚴(yán)重威脅人類生命健康的常見惡性腫瘤,其在全球的病死率排名第二。病毒性肝炎、肝硬化、黃曲霉毒素、飲用水污染及遺傳因素等均是常見的誘癌因素。與歐美國家因飲酒過量導(dǎo)致的酒精性肝硬化是肝癌的主要病因不同的是,在我國由乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)觸發(fā)的慢性乙型肝炎和肝硬化是肝癌最主要的致病因素。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查,在我國患有慢性乙型肝炎的患者約有1億左右,而由HBV相關(guān)性疾病引起的死亡每年約有50萬左右,因此深入研究HBV在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)制對(duì)降低肝癌發(fā)生率和死亡率有著重要而深遠(yuǎn)的意義。HBV是嗜肝屬不全雙鏈環(huán)狀DNA病毒,當(dāng)其感染宿主后可在肝細(xì)胞內(nèi)生長繁殖,同時(shí)激活免疫系統(tǒng)引起肝臟炎癥反應(yīng),并通過基因片段整合和反式激活作用等多種復(fù)雜機(jī)制最終導(dǎo)致了肝癌的發(fā)生和發(fā)展。乙型肝炎病毒X基因(Hepatitis B Virus X Gene,HBx)是HBV四個(gè)開放閱讀框中最小的非結(jié)構(gòu)基因,由452-465個(gè)堿基組成,其直接參與HBV的感染、復(fù)制過程。研究證實(shí)HBx蛋白可通過廣泛的反式激活作用調(diào)控宿主細(xì)胞多條信號(hào)傳導(dǎo)通路,從而影響細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞自噬和遷移能力等多種生物學(xué)過程。此外,多項(xiàng)全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)顯示HBV整合在宿主基因組上的片段約80%均是HBx片段,因此HBx還可通過由片段整合引起的基因組不穩(wěn)定性、癌基因的激活、抑癌基因的失活等效應(yīng)誘發(fā)肝癌。HBV的復(fù)制需進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,在此過程中易發(fā)生DNA序列的變異。根據(jù)HBV的變異程度可將其分為8種亞型(A-H型)及不同的準(zhǔn)種,這些不同HBV序列所攜帶的HBx DNA序列均不同。此外,HBx還可分為ayw, adr, adw, ayr四種不同的血清型。HBx序列本身也存在著點(diǎn)突變、C端截?cái)嗤蛔兒腿笔蛔內(nèi)N突變形式。這些證據(jù)表明HBx DNA序列存在多態(tài)性。HBV多種亞型及HBx基因型均可影響HCC的發(fā)生和發(fā)展,表明HBx多態(tài)性在HCC的進(jìn)程中可能存在重要的生物學(xué)功能。因此,系統(tǒng)的研究HBx多態(tài)性現(xiàn)象,進(jìn)一步挖掘其可能的生物學(xué)作用及臨床意義,可為HCC的防治提供新的證據(jù)和方向。第一部分HBV相關(guān)HCC患者HBx基因多態(tài)性分析及臨床相關(guān)性研究目的：檢測(cè)HBV相關(guān)HCC患者HBx基因的多態(tài)性并進(jìn)行臨床相關(guān)性分析,尋找具有臨床意義的HBx亞型。方法：搜集多中心HBV相關(guān)HCC患者癌及癌旁組織、血清及臨床資料,并對(duì)患者進(jìn)行長期隨訪。抽提癌、癌旁組織及血清樣本中基因組DNA,采用巢式PCR擴(kuò)增HBx片段并進(jìn)行測(cè)序。利用Molecular Evolutionary Genetics Analysis 6.05(MEGA6.05)和Cluster 3.0軟件尋找差異位點(diǎn)并進(jìn)行聚類分析。采用χ2檢驗(yàn)、Kaplan-meier法、Log-rank檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析各種多態(tài)性類型的臨床意義。結(jié)果：1、HCC患者癌和癌旁組織中分別獲得準(zhǔn)確的HBx序列：287例患者癌中獲得213條、癌旁中獲得268條準(zhǔn)確的HBx序列,癌旁中更容易獲得HBx序列；2、癌組織中的HBx序列與癌旁中的不完全相同：其中癌和癌旁HBx完全相同占39%,不同的占61%,且不同的序列中差異位點(diǎn)較分散、無規(guī)律;3、癌和癌旁組織的HBx多態(tài)性大體可分為三型：我們將聚類分析顯示的287例HCC隊(duì)列中的HBx亞型分別命名為EHBH1、EHBH2和EHBH3;4、攜帶有HBx亞型EHBH2(以下簡(jiǎn)稱HBx-EHBH2)的患者預(yù)后較好,且與多項(xiàng)臨床指標(biāo)相關(guān)：HCC患者(癌和癌旁)攜帶有HBx-EHBH2的總體生存率(OS)較高(癌,P=0.042；癌旁,P=0.041),且其在癌組織中HBx-EHBH2與腫瘤包膜相關(guān)(P=0.002),在癌旁組織中HBx-EHBH2與肝硬化(P=0.000)、TNM分期(P=0.033)、腫瘤包膜(P=0.010)、子灶(P=0.012)相關(guān)；5、驗(yàn)證隊(duì)列證明HBx-EHBH2的存在并與患者預(yù)后相關(guān)：不同地區(qū)的HCC患者隊(duì)列表明攜帶HBx-EHBH2的患者有預(yù)后較好的趨勢(shì)；6,血清中HBx DNA序列與癌旁中的相同；7,血清中的HBx-EHBH2與患者預(yù)后相關(guān)：外周血中攜帶HBx-EHBH2的患者總體生存率較高(P=0.032)。結(jié)論：HCC患者癌和癌旁組織中HBx基因均存在多態(tài)性且不完全相同；HBx亞型EHBH2在HCC進(jìn)程中有著重要的臨床意義。第二部分HBx亞型EHBH2在人基因組整合的系統(tǒng)分析目的：研究HBx-EHBH2在人基因組整合的特點(diǎn),對(duì)整合頻率和位點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)分析。方法：利用HVID(High-throughput Viral Integration Detection)技術(shù)對(duì)癌和癌旁組織進(jìn)行HBV插入片段的靶向捕獲測(cè)序。針對(duì)HBV斷點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,通過PCR和Sanger測(cè)序驗(yàn)證整合位點(diǎn)。SPSS 18軟件系統(tǒng)分析HBx-EHBH2與其它亞型在整合位點(diǎn)及頻率等方面的差異。結(jié)果：1、HBX-EHBH2與其它亞型在總體整合頻率(癌,P=0.52；癌旁,P=0.19),整合患者人數(shù)(癌,P=0.514；癌旁,P=0.228), TERT基因整合頻率(癌,P=0.933), TERT基因整合患者數(shù)(癌,P=0.819),不同區(qū)域包括外顯子(癌,P=0.782；癌旁,P=0.155)、內(nèi)含子(癌,P=0.831；癌旁,P=0.095)、基因間區(qū)(癌,P=0.767)、啟動(dòng)子(癌,P=0.552癌旁,P=0.236)整合頻率的比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；2、HBx-EHBH2與其它亞型的熱點(diǎn)整合位點(diǎn)基因或附近基因不同：癌和癌旁組織中重復(fù)插入基因均不同；3、HBx-EHBH2插入基因的功能與其它亞型不同：GO分析表明兩組整合位點(diǎn)基因或附近基因的功能不同。結(jié)論:HBx-EHBH2在人基因組的整合位點(diǎn)與其它亞型不同,且整合位點(diǎn)基因或附近基因的功能也不同,可能因此發(fā)揮了不同的生物學(xué)功能。第三部分HBx亞型EHBH2在HBV相關(guān)HCC中的作用機(jī)制研究目的：明確HBx亞型EHBH2的生物學(xué)功能,并初步探討其可能的生物學(xué)機(jī)制。方法：全基因組合成HBx的5種序列,并構(gòu)建質(zhì)粒,合成慢病毒。轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞并構(gòu)建相應(yīng)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各型HBx對(duì)細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各型穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的細(xì)胞周期和凋亡。小鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)明確各型HBx在動(dòng)物體內(nèi)功能的不同。利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件對(duì)不同型HBx蛋白空間構(gòu)象進(jìn)行預(yù)測(cè)�；虮磉_(dá)譜芯片明確HBx-B和HBx-EHBH2對(duì)細(xì)胞表達(dá)譜的影響。結(jié)果：1、成功構(gòu)建攜帶有5型HBx序列的穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞株：穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株為攜帶有HBx-A、HBx-B、HBx-EHBH2、HBx-EHBH2A和HBx-EHBH2B的SMMC-7721和Huh7肝癌細(xì)胞株；2. HBx-EHBH2和HBx-EHBH2A對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響最弱：CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)證明HBX-EHBH2和HBx-EHBH2A對(duì)細(xì)胞增殖的作用弱于HBx-A和HBx-B,而與NC組差異不明顯；3、HBx-EHBH2和HBx-EHBH2A對(duì)細(xì)胞周期的作用較弱：轉(zhuǎn)染HBx-EHBH2和HBx-EHBH2A的細(xì)胞S期所占比例低于HBx-A和HBx-B,而與NC組無明顯差異；4、HBx-EHBH2和HBx-EHBH2A對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用較弱：HBx-EHBH2和HBx-EHBH2A早期凋亡率低于HBx-A和HBx-B,而與NC組無明顯差異；5、HBx-EHBH2促進(jìn)腫瘤生長的作用較弱：皮下荷瘤后腫瘤的生長速度慢于HBx-B,與NC組無明顯差異；6、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明：HBx-EHBH2的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與HBx-B不同；7、基因表達(dá)譜芯片分析結(jié)果顯示：HBx-EHBH2調(diào)控的下游靶基因與HBx-B不同,并且兩者的下游基因所富集的功能及信號(hào)通路不同。結(jié)論：HBx-EHBH2的生物學(xué)功能明顯弱于其他類型HBx,并且主要通過HBx蛋白調(diào)控與其它亞型的下游靶基因,而發(fā)揮其生物學(xué)功能。
【關(guān)鍵詞】：HCC HBV HBx 多態(tài)性 亞型 預(yù)后分析 整合 細(xì)胞增殖
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：