本文關(guān)鍵詞：抗人CCR4重組免疫毒素的表達與生物學(xué)功能研究

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【摘要】：目的：研究酵母菌表達抗人CCR4 (Anti-hCCR4)免疫毒素蛋白,研究其生物學(xué)活性。方法：運用巴斯德畢赤酵母Pichia Pastoris表達免疫毒素蛋白,經(jīng)鎳柱和離子柱純化蛋白。用SDS-PAGE和Western Blot鑒定蛋白,用BCA法測定蛋白濃度。純化的蛋白用NHS-Sulfo生物素標(biāo)記技術(shù),用流式細胞技術(shù)檢測其對CCR4陽性細胞的特異性粘附作用。用3H標(biāo)記的蛋白合成抑制試驗和細胞增殖抑制試驗檢測免疫毒素對靶細胞的毒性作用。用流式細胞儀檢測免疫毒素蛋白對人外周血淋巴細胞中CCR4陽性細胞特異性殺滅作用。最后用免疫缺陷小鼠(NSG)尾靜脈注射腫瘤細胞,構(gòu)建腫瘤模型,檢測免疫毒素在小鼠體內(nèi)的生物學(xué)活性。結(jié)果：經(jīng)過表達和純化得到了單價Anti-hCCR4免疫毒素蛋白(70.26kDa),雙價Anti-hCCR4免疫毒素蛋白(97.57 kDa)和Foldback Diabody Anti-hCCR4免疫毒素蛋白(96.31kDa)。Anti-hCCR4免疫毒素均可特異性粘附CCR4陽性腫瘤細胞和人外周血淋巴細胞中CCR4陽性細胞群;該免疫毒素可以特異性抑制CCR4+ CCRF-CEM腫瘤細胞蛋白合成和增殖,可以特異性殺滅外周血淋巴細胞中CCR4陽性細胞群;并且該免疫毒素對CCR4陰性細胞幾乎沒有粘附和殺傷作用。在小鼠腫瘤模型內(nèi),雙價和Foldback Diabody免疫毒素在小鼠體內(nèi)可大量殺傷腫瘤細胞,延長小鼠存活時間。結(jié)論：本研究中成功表達和純化了三種Anti-hCCR4免疫毒素,通過實驗證實該免疫毒素可特異性粘附和殺滅CCR4陽性細胞,其中雙價和Foldback Diabody免疫毒素在小鼠體內(nèi)有較強的生物學(xué)活性,為下一步臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：酵母表達 CCR4 免疫毒素 流式細胞技術(shù) 腫瘤治療 小鼠模型
【學(xué)位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.5
【目錄】：

• 摘要7-8
• 文獻綜述8-14
• 1 免疫毒素概述8-10
• 1.1 免疫毒素簡介8-9
• 1.2 免疫毒素及白喉毒素抗癌癥研究進展9-10
• 2 CCR4簡介10-11
• 3 調(diào)節(jié)性T細胞在腫瘤治療中研究進展11-12
• 4 本實驗設(shè)想12-14
• 前言14-15
• 試驗材料及儀器15-20
• 1 試驗材料15-18
• 1.1 試驗動物15
• 1.2 細胞系15
• 1.3 主要藥品和試劑15-16
• 1.4 試劑溶液的配制16-18
• 2 試驗儀器18-19
• 3 數(shù)據(jù)分析及處理軟件19-20
• 試驗方法20-31
• 1 Anti-hCCR4免疫毒素的制備20-23
• 1.1 單價Anti-hCCR4免疫毒素蛋白表達20-21
• 1.2 蛋白純化21-22
• 1.3 蛋白濃度測定22
• 1.4 雙價Anti-hCCR4免疫毒素蛋白表達和純化22-23
• 1.5 Foldback Diabody Anti-hCCR4免疫毒素表達和純化23
• 2 Anti-hCCR4免疫毒素體外功能試驗23-27
• 2.1 Anti-hCCR4免疫毒素對CCRF-CEM腫瘤細胞體外蛋白合成抑制試驗23-24
• 2.2 Anti-hCCR4免疫毒素對CCRF-CEM腫瘤細胞體外增殖抑制試驗24
• 2.3 Anti-hCCR4免疫毒素對CCRF-CEM表面抗原CCR4的特異性粘附試驗24-25
• 2.4 Anti-hCCR4免疫毒素對人外周血淋巴細胞CCR4陽性細胞特異性粘附試驗25-26
• 2.5 Anti-hCCR4免疫毒素對人外周血淋巴細胞CCR4陽性細胞群特異性殺傷試驗26
• 2.6 Anti-hCCR4免疫毒素對人外周血淋巴細胞中調(diào)節(jié)性T細胞特異性粘附試驗26-27
• 3 Anti-hCCR4免疫毒素對CCR4陰性細胞生物學(xué)功能試驗27-29
• 3.1 Anti-CCR4免疫毒素對CCR4陰性腫瘤細胞的粘附作用27
• 3.2 Anti-CCR4免疫毒素對CCR4陰性腫瘤細胞的殺傷作用27-28
• 3.3 Anti-hCCR4免疫毒素對外周血淋巴細胞CCR4陰性細胞群殺傷試驗28-29
• 4 Anti-hCCR4免疫毒素體內(nèi)功能試驗29-31
• 4.1 NSG小鼠CCRF-CEM腫瘤模型的誘導(dǎo)29-30
• 4.2 Anti-hCCR4免疫毒素對小鼠體內(nèi)CCR4~+CCRF-CEM腫瘤細胞的殺滅作用試驗30-31
• 試驗結(jié)果31-49
• 1 Anti-hCCR4免疫毒素蛋白的表達31-33
• 1.1 Anti-hCCR4免疫毒素蛋白SDS-PAGE鑒定31
• 1.2 Anti-hCCR4免疫毒素蛋白Western Blot鑒定31-33
• 2 Anti-hCCR4免疫毒素生物學(xué)活性33-42
• 2.1 Anti-hCCR4免疫毒素對CCRF-CEM腫瘤細胞特異性粘附試驗33-35
• 2.2 Anti-hCCR4免疫毒素對CCRF-CEM腫瘤細胞體外蛋白合成抑制試驗35-38
• 2.3 Anti-hCCR4免疫毒素對CCRF-CEM腫瘤細胞體外增殖抑制試驗38-40
• 2.4 Anti-hCCR4免疫毒素對人外周血淋巴細胞特異性粘附試驗40
• 2.5 Anti-hCCR4免疫毒素對人外周血淋巴細胞CCR4陽性細胞群特異性殺傷作用40-41
• 2.6 Anti-hCCR4免疫毒素對調(diào)節(jié)性T淋巴細胞特異性粘附試驗41-42
• 3 Anti-hCCR4免疫毒素對CCR4陰性細胞的生物學(xué)活性42-46
• 3.1 Anti-CCR4免疫毒素對CCR4陰性腫瘤細胞粘附作用42-44
• 3.2 Anti-CCR4免疫毒素對CCR4陰性腫瘤細胞殺傷作用44-45
• 3.3 Anti-hCCR4免疫毒素對外周血淋巴細胞CCR4陰性細胞群殺傷試驗45-46
• 4 Anti-hCCR4免疫毒素體內(nèi)試驗46-49
• 4.1 小鼠CCRF-CEM腫瘤模型建立46
• 4.2 Anti-hCCR4免疫毒素對鼠體內(nèi)CCR4~+CCRF-CEM腫瘤細胞的殺滅作用試驗46-49
• 分析和討論49-54
• 1 免疫毒素的構(gòu)建,表達與純化49
• 2 Anti-hCCR4免疫毒素生物學(xué)活性49-51
• 2.1 Anti-hCCR4免疫毒素對CCR4~+CCRF-CEM腫瘤細胞粘附作用49-50
• 2.2 Anti-hCCR4免疫毒素CCRF-CEM腫瘤細胞體外蛋白合成抑制作用50
• 2.3 Anti-hCCR4免疫毒素對CCRF-CEM腫瘤細胞體外增殖抑制作用50-51
• 2.4 Anti-hCCR4免疫毒素對人外周血淋巴細胞特異性粘附作用51
• 2.5 Anti-hCCR4免疫毒素對人外周血淋巴細胞殺傷作用51
• 2.6 Anti-hCCR4免疫毒素對調(diào)節(jié)性T淋巴細胞特異性粘附作用51
• 3 Anti-hCCR4免疫毒素對CCR4陰性細胞的生物學(xué)活性51-52
• 3.1 Anti-CCR4免疫毒素對CCR4陰性腫瘤細胞粘附作用52
• 3.2 Anti-CCR4免疫毒素對CCR4陰性腫瘤細胞殺傷作用52
• 3.3 Anti-hCCR4免疫毒素對外周血淋巴細胞CCR4陰性細胞群殺傷試驗52
• 4 Anti-hCCR4免疫毒素小鼠體內(nèi)生物學(xué)活性52-54
• 4.1 小鼠CCRF-CEM腫瘤模型建立52-53
• 4.2 Anti-hCCR4免疫毒素對小鼠體內(nèi)CCR4~+CCRF-CEM腫瘤細胞的殺滅作用試驗53-54
• 全文結(jié)論54-55
• 參考文獻55-59
• Abstract59-61
• 致謝61

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 熊玉寧,王健偉;免疫毒素治療惡性血液病[J];國外醫(yī)學(xué).輸血及血液學(xué)分冊;2000年05期

2 李俊植;免疫毒素研究及臨床應(yīng)用進展 (二)臨床研究[J];中國生物制品學(xué)雜志;2004年02期

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本文編號：817436