本文關(guān)鍵詞：抗人CCR4重組免疫毒素的表達(dá)與生物學(xué)功能研究

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【摘要】：目的：研究酵母菌表達(dá)抗人CCR4 (Anti-hCCR4)免疫毒素蛋白,研究其生物學(xué)活性。方法：運(yùn)用巴斯德畢赤酵母Pichia Pastoris表達(dá)免疫毒素蛋白,經(jīng)鎳柱和離子柱純化蛋白。用SDS-PAGE和Western Blot鑒定蛋白,用BCA法測(cè)定蛋白濃度。純化的蛋白用NHS-Sulfo生物素標(biāo)記技術(shù),用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)其對(duì)CCR4陽(yáng)性細(xì)胞的特異性粘附作用。用3H標(biāo)記的蛋白合成抑制試驗(yàn)和細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)檢測(cè)免疫毒素對(duì)靶細(xì)胞的毒性作用。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫毒素蛋白對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞中CCR4陽(yáng)性細(xì)胞特異性殺滅作用。最后用免疫缺陷小鼠(NSG)尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞,構(gòu)建腫瘤模型,檢測(cè)免疫毒素在小鼠體內(nèi)的生物學(xué)活性。結(jié)果：經(jīng)過(guò)表達(dá)和純化得到了單價(jià)Anti-hCCR4免疫毒素蛋白(70.26kDa),雙價(jià)Anti-hCCR4免疫毒素蛋白(97.57 kDa)和Foldback Diabody Anti-hCCR4免疫毒素蛋白(96.31kDa)。Anti-hCCR4免疫毒素均可特異性粘附CCR4陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞和人外周血淋巴細(xì)胞中CCR4陽(yáng)性細(xì)胞群;該免疫毒素可以特異性抑制CCR4+ CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞蛋白合成和增殖,可以特異性殺滅外周血淋巴細(xì)胞中CCR4陽(yáng)性細(xì)胞群;并且該免疫毒素對(duì)CCR4陰性細(xì)胞幾乎沒(méi)有粘附和殺傷作用。在小鼠腫瘤模型內(nèi),雙價(jià)和Foldback Diabody免疫毒素在小鼠體內(nèi)可大量殺傷腫瘤細(xì)胞,延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間。結(jié)論：本研究中成功表達(dá)和純化了三種Anti-hCCR4免疫毒素,通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該免疫毒素可特異性粘附和殺滅CCR4陽(yáng)性細(xì)胞,其中雙價(jià)和Foldback Diabody免疫毒素在小鼠體內(nèi)有較強(qiáng)的生物學(xué)活性,為下一步臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：酵母表達(dá) CCR4 免疫毒素 流式細(xì)胞技術(shù) 腫瘤治療 小鼠模型
【學(xué)位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R730.5
【目錄】：

• 摘要7-8
• 文獻(xiàn)綜述8-14
• 1 免疫毒素概述8-10
• 1.1 免疫毒素簡(jiǎn)介8-9
• 1.2 免疫毒素及白喉毒素抗癌癥研究進(jìn)展9-10
• 2 CCR4簡(jiǎn)介10-11
• 3 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在腫瘤治療中研究進(jìn)展11-12
• 4 本實(shí)驗(yàn)設(shè)想12-14
• 前言14-15
• 試驗(yàn)材料及儀器15-20
• 1 試驗(yàn)材料15-18
• 1.1 試驗(yàn)動(dòng)物15
• 1.2 細(xì)胞系15
• 1.3 主要藥品和試劑15-16
• 1.4 試劑溶液的配制16-18
• 2 試驗(yàn)儀器18-19
• 3 數(shù)據(jù)分析及處理軟件19-20
• 試驗(yàn)方法20-31
• 1 Anti-hCCR4免疫毒素的制備20-23
• 1.1 單價(jià)Anti-hCCR4免疫毒素蛋白表達(dá)20-21
• 1.2 蛋白純化21-22
• 1.3 蛋白濃度測(cè)定22
• 1.4 雙價(jià)Anti-hCCR4免疫毒素蛋白表達(dá)和純化22-23
• 1.5 Foldback Diabody Anti-hCCR4免疫毒素表達(dá)和純化23
• 2 Anti-hCCR4免疫毒素體外功能試驗(yàn)23-27
• 2.1 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞體外蛋白合成抑制試驗(yàn)23-24
• 2.2 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞體外增殖抑制試驗(yàn)24
• 2.3 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)CCRF-CEM表面抗原CCR4的特異性粘附試驗(yàn)24-25
• 2.4 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞CCR4陽(yáng)性細(xì)胞特異性粘附試驗(yàn)25-26
• 2.5 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞CCR4陽(yáng)性細(xì)胞群特異性殺傷試驗(yàn)26
• 2.6 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性粘附試驗(yàn)26-27
• 3 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)CCR4陰性細(xì)胞生物學(xué)功能試驗(yàn)27-29
• 3.1 Anti-CCR4免疫毒素對(duì)CCR4陰性腫瘤細(xì)胞的粘附作用27
• 3.2 Anti-CCR4免疫毒素對(duì)CCR4陰性腫瘤細(xì)胞的殺傷作用27-28
• 3.3 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)外周血淋巴細(xì)胞CCR4陰性細(xì)胞群殺傷試驗(yàn)28-29
• 4 Anti-hCCR4免疫毒素體內(nèi)功能試驗(yàn)29-31
• 4.1 NSG小鼠CCRF-CEM腫瘤模型的誘導(dǎo)29-30
• 4.2 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)小鼠體內(nèi)CCR4~+CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞的殺滅作用試驗(yàn)30-31
• 試驗(yàn)結(jié)果31-49
• 1 Anti-hCCR4免疫毒素蛋白的表達(dá)31-33
• 1.1 Anti-hCCR4免疫毒素蛋白SDS-PAGE鑒定31
• 1.2 Anti-hCCR4免疫毒素蛋白Western Blot鑒定31-33
• 2 Anti-hCCR4免疫毒素生物學(xué)活性33-42
• 2.1 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞特異性粘附試驗(yàn)33-35
• 2.2 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞體外蛋白合成抑制試驗(yàn)35-38
• 2.3 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞體外增殖抑制試驗(yàn)38-40
• 2.4 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞特異性粘附試驗(yàn)40
• 2.5 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞CCR4陽(yáng)性細(xì)胞群特異性殺傷作用40-41
• 2.6 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞特異性粘附試驗(yàn)41-42
• 3 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)CCR4陰性細(xì)胞的生物學(xué)活性42-46
• 3.1 Anti-CCR4免疫毒素對(duì)CCR4陰性腫瘤細(xì)胞粘附作用42-44
• 3.2 Anti-CCR4免疫毒素對(duì)CCR4陰性腫瘤細(xì)胞殺傷作用44-45
• 3.3 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)外周血淋巴細(xì)胞CCR4陰性細(xì)胞群殺傷試驗(yàn)45-46
• 4 Anti-hCCR4免疫毒素體內(nèi)試驗(yàn)46-49
• 4.1 小鼠CCRF-CEM腫瘤模型建立46
• 4.2 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)鼠體內(nèi)CCR4~+CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞的殺滅作用試驗(yàn)46-49
• 分析和討論49-54
• 1 免疫毒素的構(gòu)建,表達(dá)與純化49
• 2 Anti-hCCR4免疫毒素生物學(xué)活性49-51
• 2.1 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)CCR4~+CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞粘附作用49-50
• 2.2 Anti-hCCR4免疫毒素CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞體外蛋白合成抑制作用50
• 2.3 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞體外增殖抑制作用50-51
• 2.4 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞特異性粘附作用51
• 2.5 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞殺傷作用51
• 2.6 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞特異性粘附作用51
• 3 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)CCR4陰性細(xì)胞的生物學(xué)活性51-52
• 3.1 Anti-CCR4免疫毒素對(duì)CCR4陰性腫瘤細(xì)胞粘附作用52
• 3.2 Anti-CCR4免疫毒素對(duì)CCR4陰性腫瘤細(xì)胞殺傷作用52
• 3.3 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)外周血淋巴細(xì)胞CCR4陰性細(xì)胞群殺傷試驗(yàn)52
• 4 Anti-hCCR4免疫毒素小鼠體內(nèi)生物學(xué)活性52-54
• 4.1 小鼠CCRF-CEM腫瘤模型建立52-53
• 4.2 Anti-hCCR4免疫毒素對(duì)小鼠體內(nèi)CCR4~+CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞的殺滅作用試驗(yàn)53-54
• 全文結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-59
• Abstract59-61
• 致謝61

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 熊玉寧,王健偉;免疫毒素治療惡性血液病[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).輸血及血液學(xué)分冊(cè);2000年05期

2 李俊植;免疫毒素研究及臨床應(yīng)用進(jìn)展 (二)臨床研究[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2004年02期

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本文編號(hào)：817436