本文關(guān)鍵詞：NK4增強肝癌細(xì)胞Li-7對5-FU的敏感性及其作用機制的研究

  更多相關(guān)文章： NK4 肝癌細(xì)胞 5-FU LY294002 藥物耐受

【摘要】：目的:探索HGF對肝癌細(xì)胞Li-7增殖能力、5-FU敏感性的影響。嘗試?yán)肏GF拮抗劑-NK4增強Li-7細(xì)胞在HGF存在的情況下對5-FU的敏感性,并與PI3K靶向型抑制劑LY294002比較增敏效果,同時探索NK4影響Li-7對藥物敏感性可能的分子機制。方法:1.提取并純化質(zhì)粒pc DNA3.1-NK4、pc DNA3.1。脂質(zhì)體包裹實驗檢測脂質(zhì)體與質(zhì)粒最優(yōu)轉(zhuǎn)染比例。2.將pc DNA3.1-NK4和pc DNA3.1分別轉(zhuǎn)染至Li-7細(xì)胞中,逆轉(zhuǎn)錄PCR鑒定NK4表達水平。3.MTT法檢測不同濃度HGF對Li-7細(xì)胞增殖的影響,驗證Li-7對5-FU的敏感性是否會受到HGF的影響。4.倒置顯微鏡下觀察HGF對Li-7形態(tài)的影響。5.MTT法分別檢測:在HGF、5-FU的干預(yù)下,未轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、NK4轉(zhuǎn)染組的Li-7細(xì)胞存活率的差異;LY294002是否可以逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)Li-7產(chǎn)生的5-FU耐受;LY294002對5-FU抑制HL7702、Li-7、SW480、Hep G2增殖的影響;LY294002對多種濃度的5-FU抑制Li-7增殖的影響;LY294002、PD98059、5-FU對Li-7增殖的影響。6.流式細(xì)胞術(shù)檢測NK4、HGF、LY294002對5-FU誘導(dǎo)Li-7凋亡的影響。7.Western blot檢測各組細(xì)胞中Akt、p-Akt、Bcl-2等蛋白的表達差異。結(jié)果:1.在不同濃度(0,0.2,2,20ng/ml)HGF的刺激下肝癌細(xì)胞Li-7的存活率沒有發(fā)生顯著變化(P0.05),但是當(dāng)HGF濃度達到20ng/ml時能夠顯著降低5-FU誘導(dǎo)的增殖抑制(P0.01)。2.在HGF的刺激下,Li-7細(xì)胞形態(tài)由不規(guī)則形變?yōu)楠M長形,細(xì)胞邊緣變得更加清晰,且隨HGF濃度升高形態(tài)變化越來越明顯。3.將質(zhì)粒pc DNA3.1-NK4、pc DNA3.1分別轉(zhuǎn)染至Li-7細(xì)胞中,RT-PCR鑒定結(jié)果為NK4表達成功。4.在HGF(20ng/ml)與不同濃度的5-FU(0,12.5,25,50μg/ml)的干預(yù)下,轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-NK4的Li-7細(xì)胞與轉(zhuǎn)染pc DNA3.1的細(xì)胞相比細(xì)胞存活率都明顯降低(P0.05)。5.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示在接受相同濃度的HGF(20ng/ml)與5-FU(50μg/ml)處理后,轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-NK4的Li-7細(xì)胞的凋亡率明顯低于轉(zhuǎn)染pc DNA3.1的細(xì)胞(P0.05)。6.Western blotting結(jié)果顯示NK4可以抑制HGF(20ng/ml)誘導(dǎo)的Akt的磷酸化,降低Bcl-2的表達(P0.05)。7.LY294002(10μg/ml)并沒有促進5-FU(50μg/ml)對Li-7細(xì)胞的殺傷,反而在不同濃度(0.2,2,20ng/ml)HGF干預(yù)下,細(xì)胞存活率分別提升13.1%、19.7%、7.7%(P0.05)。8.與單獨使用5-FU相比,LY294002(10μg/ml)、5-FU(50μg/ml)共同處理可以顯著降低SW480、Hep G2細(xì)胞的存活率(P0.01、P0.05);恰恰相反的是,與單獨使用5-FU相比,LY294002、5-FU共同處理提高了Li-7存活率(P0.05);單獨使用5-FU處理或LY294002、5-FU共同處理HL7702細(xì)胞,細(xì)胞存活率并沒有明顯的差異(P0.05)。9.LY294002在5-FU濃度較低(5μg/ml)時,降低了Li-7細(xì)胞的存活率(P0.01);在5-FU濃度逐漸升高(達到50μg/ml)后,LY294002又提高了細(xì)胞存活率(P0.01)。10.LY294002(10μg/ml)、PD98059(20μg/ml)、5-FU(50μg/ml)共同處理Li-7細(xì)胞與LY294002、5-FU處理細(xì)胞相比,細(xì)胞存活率沒有明顯差異(P0.05)。11.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,LY294002(10μg/ml)、5-FU(50μg/ml)共同處理與5-FU(50μg/ml)單獨處理Li-7細(xì)胞相比細(xì)胞凋亡率明顯下降(P0.05)。12.Western blotting結(jié)果顯示LY294002處理Li-7后,細(xì)胞中Akt的磷酸化程度、Bcl-2的表達量明顯降低(P0.05)。結(jié)論:1.NK4能夠抑制HGF對Li-7細(xì)胞的刺激,增強5-FU對Li-7的增殖抑制作用,提高凋亡率。2.產(chǎn)生這種抑制效果的原因可能是NK4抑制了HGF誘導(dǎo)的Akt的磷酸化,降低了Bcl-2的表達。3.進一步證實了在5-FU對Li-7的細(xì)胞毒性作用較強時,雖然LY294002能夠阻斷PI3K/Akt信號通路,降低Bcl-2的表達,但是它提高了細(xì)胞存活率、降低了凋亡率,而這種作用不是通過激活Raf/Erk信號通路實現(xiàn)的。4.本文證實了NK4可以增強Li-7對5-FU的敏感性,為NK4治療肝癌奠定一定的實驗基礎(chǔ)。探索了NK4增強化療敏感性可能的分子機制,為NK4應(yīng)用于腫瘤治療提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：NK4 肝癌細(xì)胞 5-FU LY294002 藥物耐受
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 常用縮寫詞中英文對照表12-14
• 前言14-16
• 第一部分 HGF、NK4 對LI-7 細(xì)胞 5-FU耐受性的影響16-38
• 1 材料與方法16-29
• 1.1 材料16-20
• 1.2 方法20-29
• 2 結(jié)果29-35
• 2.1 HGF對Li-7 增殖的影響29
• 2.2 HGF對Li-7 形態(tài)的影響29-30
• 2.3 HGF誘導(dǎo)Li-7 對 5-FU產(chǎn)生耐受30-31
• 2.4 質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)體最優(yōu)混合比的確定31-32
• 2.5 逆轉(zhuǎn)錄PCR鑒定NK4 表達水平32
• 2.6 NK4 逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)的 5-FU耐受32-33
• 2.7 NK4 增強 5-FU誘導(dǎo)Li-7 細(xì)胞凋亡33-34
• 2.8 NK4 降低了Akt的磷酸化水平與Bcl-2 的表達量34-35
• 3 討論35-37
• 4 結(jié)論37-38
• 第二部分NK4 逆轉(zhuǎn)LI-7 對 5-FU耐受機制的研究38-49
• 1 材料與方法38-40
• 1.1 材料38
• 1.2 方法38-40
• 2 結(jié)果40-45
• 2.1 LY294002 減弱了 5-FU對Li-7 細(xì)胞的增殖抑制作用40
• 2.2 LY294002 聯(lián)合 5-FU對Li-7、HL7702、SW480、HepG2 等細(xì)胞增殖的影響40-41
• 2.3 不同濃度的 5-FU聯(lián)合LY294002 對Li-7 增殖的影響41-42
• 2.4 LY294002、PD98059、5-FU對Li-7 細(xì)胞增殖的影響42-43
• 2.5 LY294002 降低了 5-FU誘導(dǎo)的Li-7 細(xì)胞凋亡43
• 2.6 LY294002 降低了Akt的磷酸化水平與Bcl-2 的表達量43-45
• 3 討論45-48
• 4 結(jié)論48-49
• 參考文獻49-53
• 綜述53-61
• 參考文獻58-61
• 致謝61-62
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果62-63
• 個人簡介63

【共引文獻】

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本文編號：816740