本文關(guān)鍵詞：FoxP3對甲狀腺乳頭狀癌中NIS表達(dá)的影響及機(jī)制研究

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【摘要】：背景甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤,其預(yù)后通常較好,十年生存率約達(dá)90%。甲狀腺癌術(shù)后,放射性碘治療是其常規(guī)后續(xù)治療手段,但一些病人表現(xiàn)出對放射性碘治療耐受。目前有大量文獻(xiàn)指出病人這種對放射性碘治療的耐受與位于甲狀腺細(xì)胞膜的鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體(sodium iodine symporter,NIS)表達(dá)下調(diào)有關(guān)。NIS介導(dǎo)了碘由細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn),為甲狀腺激素的合成提供了原料,其表達(dá)主要受TSH的調(diào)控,TSH不僅能促進(jìn)NIS的表達(dá)水平,而且能使其正確定位于細(xì)胞膜上。除TSH外,轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor,TGF-β1),雌激素和碘在NIS的調(diào)節(jié)上也起著重要作用;其中,TGF-β1主要通過拮抗TSH的生物學(xué)效應(yīng)來發(fā)揮其抑制甲狀腺功能及NIS表達(dá)的作用。Smads家族是一類細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子,主要位于TGF-β信號通路的下游發(fā)揮作用。TGF-β1首先結(jié)合到細(xì)胞表面一種特異性激酶(TGF-βtype II receptor,TβR-II)上,從而導(dǎo)致了TβR-I的激活,后者又使R-Smad2和R-Smad3磷酸化,磷酸化的R-Smad2和R-Smad3繼而與Smad4共同轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的表達(dá)。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子P3(Forkhead box P3,Fox P3)是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)生長和分化的重要調(diào)節(jié)因子。一直以來都認(rèn)為Fox P3僅限定于Treg細(xì)胞中特異性表達(dá),直到Hanz在胰腺癌細(xì)胞中亦發(fā)現(xiàn)了它的表達(dá),接下來在多種癌細(xì)胞株中都發(fā)現(xiàn)其有不同程度的表達(dá)。Fox P3在腫瘤細(xì)胞中能夠模仿其在Treg細(xì)胞中的功能,它通過促進(jìn)免疫抑制性細(xì)胞因子如TGF-β1分泌來抑制腫瘤特異性T細(xì)胞,從而使腫瘤逃離機(jī)體的免疫監(jiān)視。此外,有研究顯示Fox P3高表達(dá)和病人對放射性碘治療抵抗有關(guān)。由于病人對放射性碘治療的耐受與NIS表達(dá)下調(diào)有關(guān),且Fox P3在多種腫瘤中都能促進(jìn)TGF-β1分泌,而TGF-β1又是NIS表達(dá)強(qiáng)有力的抑制因子,因此推測Fox P3可能通過誘導(dǎo)TGF-β1信號通路的激活來下調(diào)NIS的表達(dá)。在本研究中,采用免疫組織化學(xué)和熒光定量PCR檢測90例甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本和40例正常甲狀腺組織中Fox P3和NIS的表達(dá)。此外,本研究組成性激活型(Constitutively active,CA)Fox P3過表達(dá)慢病毒載體來上調(diào)Fox P3的表達(dá)及活性,觀察在甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中Fox P3對NIS表達(dá)水平的影響。目的1.探討Fox P3與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征及NIS表達(dá)的關(guān)系;2.觀察Fox P3對人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中NIS表達(dá)的影響,并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討。方法1.采用免疫組織化學(xué)和熒光定量PCR檢測90例甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本和40例取自癌對側(cè)葉的正常甲狀腺組織中Fox P3和NIS的表達(dá)。2.人甲狀腺乳頭癌細(xì)胞株TPC-1于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用不同濃度的人重組TGF-β1(1,5,10 ng/m L)處理后,Real-time PCR檢測NIS m RNA的表達(dá),Western blot檢測其蛋白水平的表達(dá)。3.構(gòu)建含組成性激活型(Constitutively active,CA)Fox P3編碼序列的慢病毒載體(LV-CA-Fox P3)及空慢病毒載體(LV-NC-GFP),并轉(zhuǎn)染于TPC-1,倒置熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá),流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。4.將細(xì)胞分為對照(NC)組,過表達(dá)Fox P3(LV-CA)組及空病毒載體(LV-NC)組,Real-time PCR檢測Fox P3和TGF-β1的m RNA表達(dá);Western blot檢測Fox P3,TGF-β1及TGF-β1通路下游重要成員TβR-I,Smad3和p Smad3的蛋白表達(dá);免疫熒光檢測Fox P3,TβR-I和Psmad3的表達(dá);ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液的TGF-β1水平。5.將細(xì)胞分為對照組,LV-CA組,LV-CA加不同濃度的TGF-β1單克隆抗體組(1μmol/L,5μmol/L,10μmol/L)以及LV-NC組,Real-time PCR檢測六組細(xì)胞NIS m RNA的表達(dá),Western blot檢測其蛋白的表達(dá)。結(jié)果1.免疫組化結(jié)果顯示Fox P3在甲狀腺乳頭狀癌中的陽性率為74%,而在正常組織中均為陰性表達(dá),且Fox P3與甲狀腺外侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P0.05)有關(guān)。2.在正常甲狀腺組織中NIS主要定位于細(xì)胞膜,在腫瘤組織中其表達(dá)顯著減少,尤其在Fox P3陽性的樣本中,并且這些低表達(dá)的NIS主要定位于胞漿中。3.免疫組化結(jié)果顯示甲狀腺乳頭癌中Fox P3陽性患者的NIS表達(dá)陽性率顯著低于Fox P3陰性患者(P0.05)。Real-time PCR結(jié)果顯示甲狀腺乳頭癌中Fox P3陽性患者NIS的m RNA水平顯著低于Fox P3陰性患者(P0.05)。4.與對照組相比,隨著培養(yǎng)基中TGF-β1濃度的增加,NIS的m RNA和蛋白表達(dá)均逐漸減少;當(dāng)TGF-β1的濃度達(dá)到最大(10 ng/m L)時,NIS的m RNA和蛋白含量分別下降至對照組的6倍和2倍。5.倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示LV-CA和LV-NC組細(xì)胞中表達(dá)大量的GFP,而未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞不表達(dá)。流式細(xì)胞儀顯示對照組,LV-CA-Fox P3組和LV-NC組的GFP陽性率即轉(zhuǎn)染效率分別為0.2%,99.3%和99.3%。6.與對照組相比,LV-CA組Fox P3和TGF-β1的m RNA和蛋白表達(dá)顯著增加(P0.05);ELISA結(jié)果顯示與對照組相比,LV-CA組細(xì)胞上清液中TGF-β1的分泌顯著增加(P0.05);Western blot結(jié)果顯示LV-CA組TβR-I和p Smad3的蛋白表達(dá)較對照組顯著增加(P0.05),而Smad3無明顯變化。7.免疫熒光結(jié)果顯示,Fox P3在LV-CA組細(xì)胞中大量表達(dá),且主要位于細(xì)胞核中,而在正常組和LV-NC組細(xì)胞中Fox P3的表達(dá)量則很低。與正常組和LV-NC組細(xì)胞相比,LV-CA組細(xì)胞的TβR-I和p Smad3表達(dá)水平顯著增強(qiáng),而Smad3的表達(dá)在三組細(xì)胞間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。8.與NC組相比,LV-CA-Fox P3組NIS的m RNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P0.05),但隨著TGF-β1單克隆抗體濃度的不斷增加,NIS的m RNA及膜蛋白表達(dá)均逐漸恢復(fù)至接近正常。結(jié)論1.Fox P3在甲狀腺乳頭狀癌中的高表達(dá)與甲狀腺腺外侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),且其高表達(dá)可能下調(diào)NIS的水平;2.甲狀腺乳頭狀癌中Fox P3對NIS的下調(diào)通過TGF-β1/Smad信號通路介導(dǎo)。
【關(guān)鍵詞】：甲狀腺乳頭癌 叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子P3 鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體 TPC-1細(xì)胞 轉(zhuǎn)化生長因子β1 Smad蛋白家族
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R736.1
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-14
• 中英文縮略詞14-16
• 前言16-19
• 1 材料與方法19-33
• 2 結(jié)果33-35
• 3 討論35-38
• 4 結(jié)論38-39
• 附圖39-47
• 參考文獻(xiàn)47-50
• 綜述 叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子P3和甲狀腺乳頭狀癌的關(guān)系50-71
• 參考文獻(xiàn)62-71
• 個人簡歷71
• 在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果71-72
• 致謝72

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