本文關(guān)鍵詞：沉默PKM2對(duì)體外培養(yǎng)肺腺癌A549細(xì)胞及移植瘤輻射效應(yīng)影響的實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： 丙酮酸激酶M2型 放射治療 自噬 凋亡 人肺腺癌

【摘要】：目的:研究沉默丙酮酸激酶M2型(PKM2)對(duì)體外培養(yǎng)肺腺癌A549細(xì)胞的放射敏感性及移植瘤的放射協(xié)同作用,同時(shí)探索潛在的相關(guān)機(jī)制。方法:1.采用Western Blot法檢測正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞及多種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中PKM2蛋白的表達(dá)水平。將干擾PKM2基因的質(zhì)粒psh RNA-PKM2,轉(zhuǎn)染至肺腺癌A549細(xì)胞建立穩(wěn)定細(xì)胞系,同時(shí)設(shè)立psh RNA-Control空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染Control組,采用Western Blot法檢測psh RNA-PKM2的沉默效率。2.采用臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞活性測定法和克隆形成實(shí)驗(yàn)分別檢測沉默PKM2及加入細(xì)胞自噬抑制劑3-MA和細(xì)胞凋亡抑制劑z-VAD-fmk后,放療對(duì)A549細(xì)胞活性和克隆形成能力的影響。采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞經(jīng)處理后細(xì)胞損傷蛋白γ-H2AX的表達(dá)水平。3.采用TUNEL法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測沉默PKM2的及加入抑制劑不同組別A549細(xì)胞放療后的凋亡水平。4.采用透射電鏡和Western Blot法分別檢測沉默PKM2及加入抑制劑經(jīng)放療后A549細(xì)胞的自噬體和自噬小泡形成情況及通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化。5.采用免疫組織化學(xué)法檢測裸鼠移植瘤psh RNA-PKM2的干擾效率。干擾PKM2表達(dá)的荷瘤裸鼠移植瘤經(jīng)放療后,用游標(biāo)卡尺監(jiān)測裸鼠移植瘤體積的動(dòng)態(tài)變化,TUNEL法檢測各組裸鼠移植瘤細(xì)胞的凋亡率,并采用透射電鏡觀察裸鼠移植瘤細(xì)胞內(nèi)自噬體和自噬小泡的形成情況。結(jié)果:1.與正常肺上皮細(xì)胞相比較,A549、H460、H1299、H292和H520五種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中PKM2呈高表達(dá);成功獲得轉(zhuǎn)染psh RNA-PKM2的A549穩(wěn)定細(xì)胞株,體外實(shí)驗(yàn)psh RNA-PKM2組可顯著降低細(xì)胞PKM2的蛋白表達(dá)水平(P0.05)。2.沉默PKM2表達(dá)可顯著增加肺腺癌A549細(xì)胞的放療敏感性。與對(duì)照組相比較,照射12h與24h后,psh RNA-PKM2組細(xì)胞存活率分別減少了(12.6±5.21)%與(20±4.57)%,照射組(IR組)分別減少了(17.1±5.14)%與(28.2±6.52)%,而IR+psh RNA-PKM2組分別減少了(27.7±5.14)%與(48.7±7.52)%;克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示:IR組與psh RNA-Control組的D0值和Dq值相類似,而psh RNA-PKM2組的D0值和Dq值比其余兩組均降低(P0.05)。psh RNA-PKM2組與psh RNA-Control組的SERD0值分別為1.47與1.01,表明psh RNA-PKM2組細(xì)胞克隆形成能力顯著下降。照射后12h與24h,A549細(xì)胞損傷蛋白γ-H2AX增多,而psh RNA-PKM2組細(xì)胞損傷蛋白γ-H2AX明顯增多,提示:沉默PKM2后,照射顯著增加DNA雙鏈斷裂(P0.05)。3.沉默PKM2顯著增加A549細(xì)胞放療所誘導(dǎo)的凋亡。相比Control組和psh RNA-Control組相比,psh RNA-PKM2組和IR組的細(xì)胞凋亡率增加,而IR+psh RNA-PKM2組的凋亡細(xì)胞率顯著增加(P0.05)。加入凋亡抑制劑z-VAD-fmk后,細(xì)胞凋亡率顯著降低(P0.05)。4.沉默PKM2可增加A549細(xì)胞放療誘導(dǎo)的自噬。透射電鏡觀察顯示:IR+psh RNA-PKM2組出現(xiàn)大量自噬小泡和自噬體,psh RNA-PKM2組、IR組和IR+psh RNA-Control組則少量形成,其余組無自噬小泡和自噬體。LC3-II/I比值表達(dá)水平顯示:LC3-II/I比值在psh RNA-PKM2組增高(灰度值1.33),IR+psh RNA-PKM2組顯著增加(灰度值1.59),但I(xiàn)R+psh RNA-PKM2組加入自噬抑制劑3-MA后則顯著降低LC3-II/I比值(灰度值0.87)(P0.05)。檢測通路相關(guān)蛋白的表達(dá):與其他組相比較,IR+psh RNA-PKM2組顯著降低AKT和PDK1的磷酸化水平,而增加ERK1/2和GSK3b的磷酸化水平表達(dá)。5.z-VAD-fmk和3-MA處理后,臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞存活能力顯示:相比IR+psh RNA-PKM2組,照射后12h與24h,加入z-VAD-fmk和3-MA細(xì)胞組的細(xì)胞存活率顯著增加(P0.05)。克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示,加入抑制劑組的克隆形成能力較IR+psh RNA-PKM2組顯著增強(qiáng)(P0.05)。同時(shí)加入抑制劑后,對(duì)細(xì)胞死亡方式檢測顯示:與IR+psh RNA-PKM2組相比較,IR+pshRNA-PKM2+3-MA的細(xì)胞凋亡減少;采用Western Blot檢測IR+psh RNA-PKM2+z-VAD-fmk組的LC3表達(dá)水平顯示:LC3-II/I的比值顯著降低(灰度值0.75,P0.05)。以上結(jié)果提示:沉默PKM2后經(jīng)放療誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡與自噬之間存在交互作用。6.干擾裸鼠移植瘤PKM2的表達(dá)水平,通過誘導(dǎo)自噬和凋亡增加放射協(xié)同作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示:psh RNA-PKM2可顯著降低移植瘤的PKM2表達(dá)水平(P0.05)。與對(duì)照組比較,IR組與psh RNA-PKM2組可顯著抑制移植瘤的生長(P=0.04),IR+psh RNA-PKM2組則顯著抑制移植瘤的生長(P=0.001)。與IR組及psh RNA-PKM2組相比較,IR+psh RNA-PKM2組顯著增加移植瘤的生長延遲時(shí)間(P=0.04、0.01)。以上結(jié)果表明:沉默PKM2對(duì)移植瘤可能具有放射協(xié)同作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用TUNEL法檢測顯示:IR+psh RNA-PKM2組凋亡細(xì)胞率較其他組別顯著增加(P0.05)。且psh RNA-PKM2+IR組出現(xiàn)大量自噬小泡和自噬體形成,psh RNA-PKM2組及IR組則少量形成,其余組無自噬小泡和自噬體。結(jié)論:沉默PKM2調(diào)節(jié)自噬和凋亡可能提高人肺腺癌A549細(xì)胞的放射敏感性及移植瘤的放射協(xié)同作用,其有望成為放療肺腺癌的有效增敏靶點(diǎn),但有待進(jìn)一步研究證實(shí)。
【關(guān)鍵詞】：丙酮酸激酶M2型 放射治療 自噬 凋亡 人肺腺癌
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 縮略語/符號(hào)說明10-11
• 前言11-13
• 研究現(xiàn)狀、成果11-12
• 研究目的、方法12-13
• 1. 對(duì)象和方法13-33
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料13-14
• 1.2 實(shí)驗(yàn)所需主要試劑及溶液的配制14-17
• 1.3 主要儀器設(shè)備17
• 1.4 實(shí)驗(yàn)方法17-32
• 1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析32-33
• 2. 結(jié)果33-42
• 2.1 正常肺上皮和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞PKM2表達(dá)及穩(wěn)定細(xì)胞株的建立33-34
• 2.2 沉默PKM2表達(dá)增加肺腺癌A549細(xì)胞的放療敏感性34-35
• 2.3 沉默PKM2增加A549細(xì)胞放療誘導(dǎo)的凋亡35-36
• 2.4 沉默PKM2增加A549細(xì)胞放療誘導(dǎo)的自噬36-38
• 2.5 沉默PKM2后放療誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡與自噬間的交互作用38-39
• 2.6 干擾小鼠移植瘤PKM2的表達(dá)，，通過誘導(dǎo)自噬和凋亡增加放射協(xié)同作用39-42
• 3. 討論42-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-53
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明53-55
• 綜述 PKM2在腫瘤中的作用55-68
• 綜述參考文獻(xiàn)60-68
• 致謝68

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本文編號(hào)：806559