本文關(guān)鍵詞：FES和CLDN11基因甲基化在肝細(xì)胞癌中的作用的研究

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【摘要】：研究目的：為肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的診斷及預(yù)后尋找新的甲基化標(biāo)志物,并進(jìn)一步探索其表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。研究方法：(1)應(yīng)用Illumina 450K Infinium Methylation BeadChip對(duì)6對(duì)HCC及對(duì)應(yīng)癌旁正常組織進(jìn)行全基因組的甲基化基因掃描。(2)應(yīng)用甲基化特異性PCR技術(shù)檢測(cè)100對(duì)肝細(xì)胞癌及對(duì)應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本中FES、 CLDN11、CYP26C1、FBN1、 SEPT9、 PITX2六個(gè)基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)。(3)應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)30對(duì)肝細(xì)胞癌及對(duì)應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本中FES、CLDN11基因啟動(dòng)子的甲基化水平。(4)應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)FES和CLDN11在病人石蠟包埋組織中的蛋白表達(dá)情況。(5)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析FES和CLDN11甲基化及其蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。利用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線,探討FES和CLDN11與肝癌患者生存率的關(guān)系。通過(guò)Cox回歸模型進(jìn)行單因素和多因素統(tǒng)計(jì)分析,尋找HCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。(6)單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用5-Aza-CdR和TSA處理肝細(xì)胞癌BEL-7402細(xì)胞株。運(yùn)用MSP技術(shù)、qRT-PCR技術(shù)及western blot技術(shù)分別檢測(cè)各組細(xì)胞中的FES和CLDN11基因甲基化狀態(tài)、mRNA及蛋白表達(dá)水平變化。結(jié)果：(1)異常甲基化基因主要富集在代謝通路、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化磷酸化、細(xì)胞周期、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等通路中,從篩選出的46個(gè)與HCC相關(guān)的基因中我們挑選了6個(gè)差異最顯著的基因(FES.CLDN11、CYP26C1、FBN1、SEPT9、 PITX2)進(jìn)行進(jìn)一步篩選。(2)MSP結(jié)果顯示,在HCC中FES和CLDN11啟動(dòng)子區(qū)存在較高的甲基化率,而在正常組織中的甲基化率較低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)焦磷酸測(cè)序結(jié)果顯示,FES和CLDN11在HCC中的甲基化程度較高,而在正常肝組織中的甲基化程度較低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(4)免疫組化結(jié)果顯示,在HCC中FES的表達(dá)率為49%,在正常組織中的表達(dá)率為92%。CLDN11在HCC中的表達(dá)率為21%,而在正常組織中的表達(dá)率為87%,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(5)FES基因異常甲基化與HCC患者的腫瘤大小、AFP值、腫瘤分化程度相關(guān),FES蛋白表達(dá)也與腫瘤大小、AFP值及腫瘤分化程度相關(guān)。CLDN11基因異常甲基化與HCC患者的腫瘤大小和腫瘤分化程度相關(guān),CLDN11的表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤分化程度及腫瘤轉(zhuǎn)移有相關(guān)性(P0.05)。Kaplan-Meier生存曲線顯示HCC患者生存率與腫瘤大小、AFP值、腫瘤分化程度、腫瘤轉(zhuǎn)移情況、FES和CLDN11異常甲基化狀態(tài)、FES和CLDN11蛋白表達(dá)情況與總體生存時(shí)間(overall survival, OS)及無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival, PFS)均具有相關(guān)性。Cox回歸模型統(tǒng)計(jì)分析顯示腫瘤大于5cm 、 AFP值高于50ng/ml及腫瘤低分化與OS密切相關(guān)；AFP值高于50ng/ml、腫瘤低分化、腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移與PFS具有相關(guān)性,是預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。(6)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,未加藥組中FES和CLDN11基因啟動(dòng)子區(qū)處于完全甲基化狀態(tài)。5-Aza-CdR或TSA單獨(dú)處理后FES和CLDN11啟動(dòng)子甲基化被部分逆轉(zhuǎn),同時(shí)mRNA及蛋白表達(dá)增加,且TSA的作用比5-Aza-CdR更為顯著。聯(lián)合用藥組中FES和CLDN11甲基化被完全逆轉(zhuǎn),mRNA及蛋白水平顯著升高。結(jié)論：在HCC中,FES和CLDN11基因啟動(dòng)子均處于高甲基化狀態(tài),并且其蛋白表達(dá)明顯低于正常肝臟組織,并參與了抑制其轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的過(guò)程。使用藥物5-Aza-CdR和TSA可逆轉(zhuǎn)HCC甲基化狀態(tài),使基因恢復(fù)表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：肝細(xì)胞癌 DNA甲基化 FES CLDN11
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 中英文縮寫詞對(duì)照表12-13
• 前言13-19
• 材料與方法19-36
• 結(jié)果36-40
• 討論40-44
• 結(jié)論44-45
• 附圖表45-57
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 致謝61-62
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)位論文目錄62-63
• 附件63

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