發(fā)布時(shí)間：2017-09-04 19:10

  本文關(guān)鍵詞：基于鏈特異性測(cè)序的肝癌HepG2細(xì)胞系IncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

  更多相關(guān)文章： HL-7702/HepG2 TNF-α 去核糖體RNA鏈特異性測(cè)序 lncRNA-mRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

【摘要】：對(duì)于肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制仍然缺乏一個(gè)系統(tǒng)的認(rèn)識(shí),特別是不同致病因素及其相互作用在肝癌的作用仍知之甚少,尚未確定的關(guān)鍵基因組或者分子異常表達(dá)對(duì)HCC診斷率提高或介入治療的靶向性都有幫助。最近的數(shù)據(jù)表明,非編碼RNA發(fā)現(xiàn)及功能研究表明其在肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演著非常重要的角色。深入研究非編碼RNA在肝癌發(fā)生過(guò)程中的分子作用機(jī)制,從而篩選新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)成為當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)。腫瘤壞死因子TNF-α主要是由脂多糖刺激巨噬細(xì)胞而分泌、具有多種生物活性的炎性細(xì)胞因子,與其他細(xì)胞因子共同作用,激活免疫反應(yīng),導(dǎo)致腫瘤壞死。本研究以HL-7702/HepG2作為實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)并分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組,分別對(duì)其總RNA去后rRNA采用鏈特異性RNA測(cè)序技術(shù),使用生物信息學(xué)方法獲得mRNA/IncRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù),同時(shí)對(duì)于差異mRNA進(jìn)行了功能注釋,為研究IncRNA調(diào)控作用,使用DIANA-TarBase v7.0和IncBaseSoftware分別得到miRNA-mRNA、 miRNA-IncRNA關(guān)系對(duì),最終得到IncRNA-miRNA-mRNA三元互相調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本論文試圖分析在肝癌發(fā)生及TNF-α誘導(dǎo)過(guò)程中與其關(guān)聯(lián)的miRNA.mRNA和IncRNA,構(gòu)建IncRNA-miRNA-mRNA三元互相調(diào)控網(wǎng)絡(luò),從而篩選出特定mRNA/lncRNA作為腫瘤早期診斷標(biāo)志物、惡性評(píng)估及預(yù)后判斷指標(biāo),同時(shí)也為分子生物學(xué)機(jī)制提供—定的理論依據(jù)。本論文主要分為兩部分：1.培養(yǎng)HL-7702及HepG2細(xì)胞系,進(jìn)行去核糖體鏈特異性建庫(kù)測(cè)序,使用生物信息學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控、read比對(duì)、轉(zhuǎn)錄本組裝等,采用FPKM的方法對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行歸一化,篩選出具有顯著差異表達(dá)的mRNA/IncRNA。共得到差異表達(dá)的mRNA 3035個(gè),其中上調(diào)表達(dá)1384個(gè),下調(diào)表達(dá)1651個(gè)；顯著差異表達(dá)的IncRNA有57個(gè),其中上調(diào)的有23個(gè),下調(diào)的有34個(gè)(篩選標(biāo)準(zhǔn)|log2 ratio|1, FDR0.01)。對(duì)于差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行了GO注釋,發(fā)現(xiàn)了其中與細(xì)胞增殖和胞凋亡、死亡有關(guān)的共有23個(gè),同時(shí)也發(fā)現(xiàn)4個(gè)與腫瘤發(fā)生相關(guān)的通路：ErbB、JAK-STAT、mTOR以及WNT signalingpathways,表明相關(guān)基因參與了上述生物學(xué)過(guò)程促進(jìn)了肝癌的發(fā)生。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室之前有IniRNA相關(guān)研究,miRNA和IncRNA及mRNA都存在相互調(diào)控,我們采用DIANA TOOL生物信息學(xué)分析工具對(duì)差異表達(dá)IncRNA進(jìn)行了IncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析,最終得到轉(zhuǎn)錄后水平上非編碼RNA在肝癌發(fā)生過(guò)程中的調(diào)控圖。2.培養(yǎng)HepG2細(xì)胞系,其中一組使用TNF-α處理3小時(shí),然后對(duì)處理前后的細(xì)胞系進(jìn)行去核糖體RNA鏈特異建庫(kù)測(cè)序。采用第一部分相同的生物信息學(xué)分析策略,得到有顯著差異表達(dá)的mRNA/IncRNA。發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的mRNA114個(gè),其中上調(diào)102個(gè),下調(diào)表達(dá)12個(gè)；差異IncRNA共發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的46個(gè),其中上調(diào)38個(gè),下調(diào)8個(gè)(|log2 (fold-change)|1, q_value0.05)。對(duì)于差異表達(dá)的mRNA的功能注釋發(fā)現(xiàn),一些炎癥因子IL6, ILIB、IL8參與到TNF-α介導(dǎo)的凋亡與癌癥通路,同時(shí)也注意到NF-KB通路中NFKIBA, NFKB1, IKBKE等基因的變化,這些差異基因一起參與了TNF-α介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室之前有miRNA相關(guān)研究,miRNA和IncRNA及mRNA都存在相互調(diào)控,所以對(duì)于差異表達(dá)IncRNA我們采用DIANA TOOL工具進(jìn)行了IncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析,得到轉(zhuǎn)錄后水平上三種RNA之間調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。本研究選取HL-7702和HepG2細(xì)胞系作為研究對(duì)象,其中一組HepG2細(xì)胞系使用TNF-α進(jìn)行處理,希望獲得腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中以及TNF-α介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中的分子機(jī)制,得到在mRNA和非編碼RNA層次上調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖,然而還需要更多的實(shí)驗(yàn)支持。
【關(guān)鍵詞】：HL-7702/HepG2 TNF-α 去核糖體RNA鏈特異性測(cè)序 lncRNA-mRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 緒論12-22
• 1.1 研究背景12-20
• 1.1.1 高通量測(cè)序技術(shù)13-15
• 1.1.2 lncRNA研究15-18
• 1.1.2.1 lncRNA概述15-16
• 1.1.2.2 lncRNA與肝癌研究16-18
• 1.1.3 TNF-α簡(jiǎn)介18-20
• 1.1.3.1 TNF-α的命名及結(jié)構(gòu)18-19
• 1.1.3.2 TNF-α的功能19
• 1.1.3.3 TNF-α的信號(hào)通路19-20
• 1.2 研究?jī)?nèi)容及意義20-21
• 1.3 論文組織結(jié)構(gòu)21-22
• 第二章 HL-7702/HepG2肝癌細(xì)胞lncRNA/mRNA表達(dá)譜22-42
• 2.1 引言22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法22-30
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)22
• 2.2.2 Trizol法Total RNA提取22-23
• 2.2.3 總RNA樣本質(zhì)量檢測(cè)23
• 2.2.4 測(cè)序流程23-25
• 2.2.5 mRNA/lncRNA測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析25-30
• 2.3 mRNA表達(dá)譜分析30-36
• 2.3.1 表達(dá)差異歸一化方法30-31
• 2.3.2 數(shù)據(jù)篩選31-32
• 2.3.3 mRNA功能注釋32-34
• 2.3.4 可變剪切分析34-36
• 2.4 lncRNA表達(dá)譜36-39
• 2.4.1 lncRNA統(tǒng)計(jì)分析36
• 2.4.2 lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)36-39
• 2.4.2.1 lncRNA-miRNA相互調(diào)控分析36-37
• 2.4.2.2 mRNA-miRNA表達(dá)譜關(guān)聯(lián)分析37-38
• 2.4.2.3 lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控分析結(jié)果38-39
• 2.5 本章小結(jié)39-42
• 第三章 TNF-α處理前后HepG2肝癌細(xì)胞mRNA/lncRNA表達(dá)譜42-56
• 3.1 引言42
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法42-48
• 3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)42
• 3.2.2 總RNA樣本質(zhì)量檢測(cè)42
• 3.2.3 測(cè)序流程42-44
• 3.2.4 mRNA/lncRNA測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析44-48
• 3.3 mRNA表達(dá)譜分析48-51
• 3.3.1 mRNA表達(dá)差異基因48-49
• 3.3.2 mRNA功能注釋49-50
• 3.3.3 可變剪切分析50-51
• 3.4 lncRNA差異分析51-53
• 3.4.1 lncRNA統(tǒng)計(jì)分析51-52
• 3.4.2 lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)52-53
• 3.4.2.1 lncRNA-miRNA相互調(diào)控分析52
• 3.4.2.2 mRNA-miRNA表達(dá)譜關(guān)聯(lián)分析52
• 3.4.2.3 lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控分析結(jié)果52-53
• 3.5 本章小結(jié)53-56
• 第四章 總結(jié)與展望56-60
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 附表一 與癌癥相關(guān)的mRNA及其富集部分GO Term66-73
• 附表二 lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖73-75
• 附表三 與TNF-α誘導(dǎo)相關(guān)的mRNA及其富集的GO Tem75-80
• 致謝80-81
• 作者簡(jiǎn)介81

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：793310