本文關(guān)鍵詞：RUNX3通過上調(diào)miR-29b表達來抑制胃癌增殖及遷移的分子機制

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【摘要】：背景：胃癌在世界范圍內(nèi)是一種高發(fā)的惡性腫瘤,特別是在中國,胃癌的發(fā)病率高,預(yù)后差,病人的存活期限短,因此探討胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制,尋找有效的診斷標(biāo)志及治療靶點是胃癌早期識別和干預(yù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。RUNX3是Runt轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,其分子中含有高度保守的Runt結(jié)構(gòu)域,Runt結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)RUNX3蛋白與靶基因啟動子區(qū)特定DNA結(jié)合元件的相互作用,從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。目前研究認為,RUNX3是一種腫瘤抑制因子,可與TGF-P信號途徑下游的Smad3/4相互作用,激活細胞周期抑制蛋白p21、促凋亡分子Bim等表達,從而促進細胞周期停滯及細胞凋亡；RUNX3還可直接靶向激活Claudin-1,抑制Aktl、VEGF等,從而抑制胃癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移及血管生成。但RUNX3作為一種轉(zhuǎn)錄因子能否通過調(diào)節(jié)非編碼的microRNA表達來發(fā)揮其生物學(xué)功能目前尚不完全清楚。本論文中,我們首先用miRNA芯片篩查了RUNX3所調(diào)節(jié)的1miRNAs,發(fā)現(xiàn)RUNX3過表達后miR-29b上調(diào)最為顯著,用生物信息學(xué)分析miR-29b的啟動子,發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)存在假定的RUNX3的結(jié)合位點,因此,我們選擇miR-29b作為研究對象。我們用qRT-PCR驗證了芯片結(jié)果,并探討了RUNX3調(diào)節(jié)miR-29b表達的機制及RUNX3通過調(diào)節(jié)miR-29b影響細胞增殖及遷移的分子機制。目的：探討RUNX3調(diào)節(jié)胃癌細胞中miR-29b表達的分子機制；解析miR-29b在胃癌中的生物學(xué)功能及其調(diào)控的下游靶基因；并闡明RUNX3能否通過調(diào)節(jié)miR-29b來抑制胃癌細胞的增殖及遷移。方法：1.將RUNX3過表達質(zhì)粒及針對RUNX3的干擾siRNA及其相應(yīng)的對照轉(zhuǎn)染胃癌細胞,利用qRT-PCR檢測不同轉(zhuǎn)染對胃癌細胞中miR-29b表達的影響。2.利用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗檢測RUNX3蛋白與miR-29b啟動子區(qū)相應(yīng)結(jié)合元件在細胞內(nèi)的相互作用。3.構(gòu)建miR-29b啟動子-熒光素酶報告基因載體及RUNX3結(jié)合位點發(fā)生突變的突變載體,利用熒光素酶活性檢測實驗檢測RUNX3對miR-29b啟動子活性的影響。4.將Smad3過表達質(zhì)粒及相應(yīng)的對照載體分別轉(zhuǎn)染胃癌細胞,利用qRT-PCR及雙熒光素酶活性檢測實驗分別檢測Smad3對miR-29b表達的影響及對miR-29b啟動子活性的影響。將RUNX3與Smad3過表達載體共轉(zhuǎn)染胃癌細胞,熒光素酶活性檢測RUNX3能否與Smad3協(xié)同增加miR-29b的啟動子活性。5.用qRT-PCR檢測RUNX3和miR-29b在胃癌和癌旁組織中的表達,統(tǒng)計學(xué)分析胃癌組織標(biāo)本中RUNX3與niR-29b表達的相關(guān)性。6.在胃癌細胞中轉(zhuǎn)染niR-29b mimics及inhibitor后,利用Transwell、EdU方法檢測miR-29b對細胞增殖能力及侵襲轉(zhuǎn)移的影響。7.將miR-29b mimics及inhibitor轉(zhuǎn)染胃癌細胞,用qRT-PCR、Western blot等方法在胃癌細胞中檢測miR-29b對靶基因DNMT3A、DNMT3B、KDM2A等表達的調(diào)控。構(gòu)建靶基因3’-UTR熒光素酶報告基因載體及突變載體,利用熒光素酶活性檢測實驗檢測miR-29b能否與靶基因3’-UTR直接結(jié)合。結(jié)果：1. RUNX3過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細胞后,miR-29b的表達水平明顯升高；反之,RUNX3 siRNA轉(zhuǎn)染細胞以干擾細胞中RUNX3的表達后, miR-29b的表達水平顯著下降；而RUNX3的Runt結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變的突變載體轉(zhuǎn)染細胞,miR-29b的表達水平?jīng)]有明顯改變。2. ChIP實驗表明RUNX3可直接結(jié)合在miR-29b的啟動子區(qū)；熒光素酶活性檢測實驗表明RUNX3可顯著增加1miR-29b的啟動子活性。3.在胃癌細胞中Smad3過表達可顯著增加miR-29b的表達及啟動子活性,RUNX3與Smad3共轉(zhuǎn)染后可協(xié)同增加miR-29b的啟動子活性。4.臨床胃癌和癌旁組織檢測表明：miR-29b在76%的胃癌組織中表達水平顯著降低,統(tǒng)計學(xué)分析表明：miR-29b在胃癌組織中顯著低表達,并且其表達水平與腫瘤大小、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等具有相關(guān)性,即：腫瘤越大,局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越多的組織,miR-29b的表達水平越低。進一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)：胃癌組織中RUNX3與miR-29b的表達水平呈顯著正相關(guān)。5. miR-29b mimics轉(zhuǎn)染胃癌細胞后,細胞的增殖及遷移能力均明顯下降,反之,miR-29b inhibitor可以顯著促進細胞的增殖及遷移。6.在胃癌細胞中,我們發(fā)現(xiàn)了1miR-29b調(diào)控的新靶點KDM2A, miR-29b可顯著降低KDM2A的mRNA和蛋白水平,并且可以直接與KDM2A的Y-UTR區(qū)直接結(jié)合,從而抑制其表達。7.利用KDM2A特異的siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細胞,EdU和Transwell分別檢測細胞的增殖及遷移能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)KDM2A siRNA轉(zhuǎn)染可顯著降低細胞的增殖及遷移能力；在轉(zhuǎn)染miR-29b inhibitor的細胞中同時轉(zhuǎn)染KDM2A siRNA可部分逆轉(zhuǎn)miR-29b inhibitor轉(zhuǎn)染造成的細胞增殖及遷移的升高。表明miR-29b對細胞增殖及遷移的影響部分通過調(diào)控KDM2A實現(xiàn)的。8.我們進一步檢測了miR-29b是否參與RUNX3介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng),將RUNX3表達載體轉(zhuǎn)染胃癌細胞后,發(fā)現(xiàn)細胞的增殖及遷移能力均顯著降低,在轉(zhuǎn)染RUNX3的細胞中同時轉(zhuǎn)染miR-29b inhibitor可部分逆轉(zhuǎn)RUNX3過表達引起的生物學(xué)效應(yīng),即細胞的增殖及遷移能力得到部分回復(fù)。結(jié)論：在胃癌中RUNX3協(xié)同Smad3誘導(dǎo)1miR-29b的表達,miR-29b表達升高可通過靶向抑制KDM2A來抑制胃癌細胞的增殖及遷移,并且RUNX3可通過調(diào)節(jié)miR-29b/KDM2A抑制細胞增殖及遷移,該發(fā)現(xiàn)提供了一種RUNX3調(diào)節(jié)細胞生物學(xué)功能的新機制。
【關(guān)鍵詞】：胃癌 RUNX3 miR-29b KDM2A
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• Abstract10-14
• 符號說明14-15
• 前言15-18
• 實驗材料與方法18-40
• 實驗結(jié)果40-46
• 討論46-49
• 附圖表49-62
• 參考文獻62-68
• 致謝68-69
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄69-70
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表70

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本文編號：790065