本文關(guān)鍵詞：miR-1000在對蝦抗病毒免疫中的作用及miR-71促進胃癌細胞自噬的機制

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【摘要】：MicroRNA (miRNA)是一類長度為22nt左右的內(nèi)源非編碼小RNA,進化上比較保守,廣泛存在于動物、植物還有病毒等多種生物中。miRNA通過種子序列(第2-8個堿基)與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)(untranslational region, UTR)配對結(jié)合,進而實現(xiàn)其對基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。本論文對miRNA在病毒感染中的作用及miRNA調(diào)控自噬的機制進行了研究。研究發(fā)現(xiàn),miRNA在病毒與宿主互作的過程中起關(guān)鍵作用。白斑綜合癥病毒(White Spot Syndromic Virus, WSSV)是一種致病力極強的雙鏈DNA病毒,可以感染大部分蝦蟹,感染后會出現(xiàn)白色斑點,死亡率極高,帶來巨大經(jīng)濟損失。本實驗室前期研究表明,WSSV感染對蝦后,對蝦的miRNA表達譜發(fā)生了明顯改變,對蝦編碼的miR-1000可能參與對蝦抗病毒免疫。因此,本論文進一步探索對蝦miR-1000的抗病毒機理。研究發(fā)現(xiàn),WSSV感染對蝦后,對蝦miR-1000表達顯著上調(diào),說明其與對蝦抗病毒有關(guān)。在High Five昆蟲細胞中進行試驗,結(jié)果顯示對蝦miR-1000與其靶基因即病毒早期基因wsv191和wsv407直接互作。對蝦體內(nèi)試驗表明,對蝦血淋巴細胞中miR-1000過表達后,2個靶基因表達量明顯下調(diào)：當(dāng)敲低miR-1000表達時,wsv191和wsv407表達量顯著上調(diào)。昆蟲細胞試驗和對蝦體內(nèi)試驗表明,miR-1000可調(diào)控靶基因wsv191和wsv407的表達。在對蝦體內(nèi),miR-1000過表達后,WSSV拷貝數(shù)和病毒感染對蝦的死亡率與對照組相比都明顯下降。利用反義核酸敲低miR-1000表達后,WSSV拷貝數(shù)和對蝦死亡率與對照組相比顯著上升。研究發(fā)現(xiàn),病毒早期基因wsv191和wsv407在WSSV復(fù)制過程中起重要作用,wsv191和wsv407的下調(diào)表達會降低WSSV拷貝數(shù)和對蝦死亡率。這些結(jié)果說明,對蝦編碼的miR-1000在病毒感染中可通過作用于病毒早期基因wsv191和wsv407來發(fā)揮抗病毒作用。為了探究宿主miR-1000是否同時調(diào)控這兩個靶基因的表達,分別從miR-1000介導(dǎo)靶基因mRNA降解的體外試驗和miR-1000與靶基因mRNA細胞內(nèi)共定位兩方面研究。利用凝膠遷移阻滯技術(shù),研究發(fā)現(xiàn)miR-1000在Ago復(fù)合體中能同時作用于wsv191和wsv407。利用熒光原位雜交技術(shù),發(fā)現(xiàn)miR-1000和靶基因wsv191以及wsv407在對蝦血淋巴細胞中共定位。因此,本研究揭示了動物miRNA可同時調(diào)控兩個靶基因表達。自噬在真核生物中廣泛存在,將細胞內(nèi)變性、損傷或衰老的蛋白質(zhì)和細胞器運輸?shù)饺苊阁w中進行降解,為細胞正常生命活動提供能量。正常細胞中自噬活性通常比較低,而腫瘤發(fā)生發(fā)展的階段以及腫瘤的類型都會影響自噬的活性。一方面,自噬能有效防止代謝廢物對細胞及基因組的損傷,發(fā)揮抑癌作用。另一方面,自噬可為腫瘤細胞提供各種能量物質(zhì),有助于腫瘤細胞在低氧和低營養(yǎng)的情況下存活。研究表明,腫瘤細胞中miRNA可以調(diào)控許多自噬相關(guān)基因,miRNA的表達或缺失都會引起自噬水平的改變,從而影響腫瘤細胞的生長。本實驗室已有研究發(fā)現(xiàn),對蝦miR-71通過抑制親環(huán)素基因表達,誘導(dǎo)細胞自噬,在病毒感染中促進病毒復(fù)制。由于miR-71在不同物種中十分保守,我們猜測在胃癌細胞中miR-71可能調(diào)控細胞自噬,因此對這一問題進行了研究。研究發(fā)現(xiàn),不同胃癌細胞中miR-71表達量都要比胃永生化細胞GES中的表達量高,miR-71過表達能增強胃癌細胞自噬水平,miR-71敲低則減弱自噬水平,說明miR-71能夠影響胃癌細胞自噬水平的變化。miR-71可以靶向3條與自噬有關(guān)的靶基因即G3BP1、MTMR4和PAK2,在High Five昆蟲細胞中,miR-71可與這3條靶基因直接互作；胃癌細胞中的試驗表明,miR-71過表達使靶基因表達量下調(diào),敲低miR-71表達則使靶基因表達量上調(diào)。研究還發(fā)現(xiàn),G3BP1、MTMR4和PAK2在胃癌細胞中能夠抑制細胞自噬。這些結(jié)果說明,miR-71可通過作用于G3BP1、MTMR4和PAK2來影響胃癌細胞自噬活性。為了探究miR-71是否同時調(diào)控3個靶基因的表達,一方面利用凝膠遷移阻滯技術(shù)研究miR-71介導(dǎo)靶基因mRNA的降解,另一方面進行miR-71與靶基因mRNA細胞內(nèi)共定位分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-71在Ago復(fù)合體中可同時作用于3個靶基因,miR-71和靶基因G3BP1、MTMR4以及PAK2在胃癌細胞中共定位。因此,本研究揭示了miR-71通過同時作用于3個與自噬有關(guān)的靶基因(G3BP1、MTMR4和PAK2)促進胃癌細胞自噬。
【關(guān)鍵詞】：miR-1000 病毒感染 miR-71 自噬
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S945.4;R735.2
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 1 引言13-25
• 1.1 microRNA作用的機制13-16
• 1.1.1 microRNA的產(chǎn)生過程13-14
• 1.1.2 microRNA作用于靶基因的機制14-15
• 1.1.3 microRNA的功能15-16
• 1.2 microRNA在病毒感染中的作用16-19
• 1.2.1 宿主編碼的microRNA16-17
• 1.2.2 病毒編碼的microRNA17-19
• 1.3 microRNA對自噬的調(diào)控作用19-23
• 1.3.1 自噬關(guān)鍵基因20-22
• 1.3.2 參與自噬調(diào)控的microRNA22
• 1.3.3 自噬與腫瘤的關(guān)系22-23
• 1.4 本論文研究的目的與意義23-25
• 2 材料與方法25-47
• 2.1 材料25-31
• 2.1.1 實驗用動物、細胞、菌株及質(zhì)粒25
• 2.1.2 主要試劑25-26
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備26-28
• 2.1.4 常用溶液和培養(yǎng)基28-31
• 2.2 方法31-47
• 3 結(jié)果與分析47-79
• 3.1 miR-1000在對蝦抗病毒免疫中的作用47-63
• 3.1.1 miR-1000與病毒感染的關(guān)系47-50
• 3.1.2 miR-1000抗病毒的機制50-55
• 3.1.3 靶基因wsv191和wsv407在病毒感染中的作用55-57
• 3.1.4 miR-1000同時調(diào)控兩個靶基因表達57-63
• 3.1.5 對蝦編碼的miR-1000在病毒感染中的作用模式63
• 3.2 miR-71促進胃癌細胞自噬的機制63-79
• 3.2.1 miR-71與自噬調(diào)控的關(guān)系63-66
• 3.2.2 miR-71作用機制66-73
• 3.2.3 miR-71靶基因與自噬的關(guān)系73-76
• 3.2.4 miR-71同時調(diào)控3個靶基因表達76-79
• 4 討論79-82
• 5 小結(jié)與展望82-84
• 參考文獻84-95
• 作者簡歷95-96
• 致謝96

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