發(fā)布時間：2017-09-01 00:37

  本文關(guān)鍵詞：丙酮酸鈉對紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

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【摘要】：紅細(xì)胞(red blood cell,RBC)作為機(jī)體血液的主要細(xì)胞組分,其主要功能是運(yùn)輸O2和CO2。紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)的特殊性使其較其他細(xì)胞更易遭受自由基攻擊,發(fā)生氧化損傷。首先,紅細(xì)胞膜富含不飽和脂肪酸;其次胞內(nèi)的主要成分是血紅蛋白,富含鐵,而鐵是催化自由基反應(yīng)的有效劑;最后,紅細(xì)胞無線粒體,細(xì)胞核等細(xì)胞器使其發(fā)生損傷后無修復(fù)能力。紅細(xì)胞發(fā)生氧化損傷后結(jié)構(gòu)功能均會發(fā)生變化。首先,ROS會攻擊紅細(xì)胞胞內(nèi)的主要成分--血紅蛋白,使其氧化,轉(zhuǎn)變?yōu)楦哞F血紅蛋白(Methehemoglobin,Met Hb),紅細(xì)胞失去攜氧能力影響組織氧供;同時血紅蛋白氧化會使珠蛋白交聯(lián)形成二硫鍵,沉積在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè),影響膜流動性。其次,ROS攻擊紅細(xì)胞膜,會使膜脂質(zhì)過氧化,膜蛋白交聯(lián),最終導(dǎo)致膜流動性降低,硬度增加從而降低紅細(xì)胞變形性�？偠灾�,ROS攻擊會破壞紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。在多種生理病理?xiàng)l件下紅細(xì)胞都易發(fā)生氧化損傷。如運(yùn)動性氧化應(yīng)激會引起紅細(xì)胞氧化損傷,降低血液供氧能力,加深組織缺氧從而影響機(jī)體的運(yùn)動能力和恢復(fù)過程;體外接觸過多的氧化劑,如鐵氰化合物或苯胺顏料等會使血紅蛋白氧化,形成高鐵血紅蛋白癥,影響組織氧供;輻射引起體內(nèi)自由基增多,紅細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化,滲透性增強(qiáng),最終會導(dǎo)致溶血。由此可見紅細(xì)胞氧化損傷引起的結(jié)構(gòu)功能變化會對機(jī)體產(chǎn)生一定的危害,其防治十分必要。目前常使用抗氧化劑對氧化損傷進(jìn)行防治。常用的抗氧化劑包括內(nèi)源性抗氧化劑(如維他命E、維他命C等)和外源性抗氧化劑(主要是植物提取物,如紅景天、復(fù)方天葡片等)。由于機(jī)體內(nèi)存在許多自由基反應(yīng)形態(tài),自由基間可以轉(zhuǎn)換,單一的自由基清除劑如VE、Vc等不能有效的阻斷多態(tài)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。植物提取物,如紅景天等療效確切,但作為外源性抗氧化劑,植物提取物作用緩慢,通常需要在發(fā)生氧化損傷前使用至少5天,有時甚至需要使用長達(dá)20天,這種緩慢的作用機(jī)制限制了它們在抗紅細(xì)胞急性氧化損傷上的使用。另外,植物提取物的成分不單一,對提取工藝要求較高,并且其作用機(jī)理較為復(fù)雜。因此我們期望尋找一種內(nèi)源性的、成分單一的小分子化合物,用于紅細(xì)胞氧化損傷防治。丙酮酸鈉(sodium pyruvate,SP)是丙酮酸的鈉鹽。丙酮酸是一種內(nèi)源性的小分子化合物,是糖代謝途徑中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物,處于有氧代謝和無氧代謝的交匯處,可以進(jìn)入三羧酸循環(huán),代謝終產(chǎn)物是二氧化碳和水,也可以在無氧酵解中被轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗�。丙酮酸鈉本身具有抗炎、抗氧化、多器官保護(hù)和糾正酸中毒等作用。研究表明,丙酮酸鈉在失血性休克液體復(fù)蘇、腦損傷和缺血再灌注損傷模型中能夠保護(hù)器官功能,同時改善機(jī)體或器官氧化應(yīng)激狀態(tài);另外丙酮酸鈉在防治糖尿病引起的白內(nèi)障、保護(hù)胰島細(xì)胞避免鋅中毒損傷等許多與氧化損傷密切相關(guān)的疾病治療中也取得一定成效。但是其對紅細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用至今未有報道。值得注意的是,使用含有丙酮酸鈉的復(fù)壯液對儲存血進(jìn)行洗滌,發(fā)現(xiàn)能夠恢復(fù)紅細(xì)胞ATP水平,改善紅細(xì)胞功能。綜上所述,丙酮酸鈉既是能量代謝底物同時具有抗氧化的作用,針對紅細(xì)胞特殊的結(jié)構(gòu),我們認(rèn)為其對紅細(xì)胞氧化損傷能起到更好的保護(hù)作用。因此本研究擬在體外建立合適的紅細(xì)胞氧化損傷模型,研究丙酮酸鈉對紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用,并對其保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行探討。第一部分:建立和篩選合適的紅細(xì)胞氧化損傷模型采用大鼠紅細(xì)胞建立氧化損傷模型,并對吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate,PMS)、過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)、亞硝酸鈉(sodium nitrite,Na NO2)等三種氧化劑的作用效果進(jìn)行篩選。頸動脈采集大鼠血液,離心去除白細(xì)胞,獲得紅細(xì)胞重懸液后分為四組:對照組;PMS組(終濃度為25、50和100μM);H2O2組(終濃度為0.5、5和8 m M);Na NO2組(終濃度為0.5、1和1.5 m M)。其中,H2O2組中還需加入終濃度為0.4 m M疊氮化鈉(sodium azide,Na N3)溶液以防止加入的過氧化氫被酶解。37°C水浴1h,用自體血漿調(diào)節(jié)紅細(xì)胞壓積至40%,測定紅細(xì)胞氧化損傷的主要指標(biāo)Met Hb含量以及聚集性、變形性等血液流變學(xué)指標(biāo)。結(jié)果表明:三種氧化劑作用紅細(xì)胞后,與基礎(chǔ)值相比Met Hb含量均顯著升高(P0.05),說明三種氧化劑均使紅細(xì)胞產(chǎn)生一定程度的氧化損傷。在紅細(xì)胞聚集指數(shù)方面,H2O2組隨濃度升高呈下降趨勢,并在濃度為8 m M時與對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);各濃度的PMS和Na NO2對紅細(xì)胞聚集指數(shù)均無明顯影響(P0.05)。在紅細(xì)胞聚集時間上,與對照組相比,H2O2作用濃度為5 m M和8 m M時聚集時間明顯升高(P0.05);PMS對聚集時間無明顯影響;Na NO2作用后聚集時間降低(P0.05),但隨著作用濃度升高聚集時間呈回升趨勢,在濃度為1.5m M時與對照組比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在紅細(xì)胞變形性方面,H2O2和PMS作用紅細(xì)胞后,不同剪切速率(shear rate,SHR)下的紅細(xì)胞變形性與對照組相比均顯著下降(P0.05);Na NO2作用紅細(xì)胞后,SHR≤100 s-1時,變形性降低(P0.05),但隨著SHR的增大,紅細(xì)胞變形性有升高趨勢,SHR≥600 s-1時,Na NO2組變形性顯著高于對照組(P0.05)。小結(jié):Met Hb含量和紅細(xì)胞變形性等流變學(xué)指標(biāo)是評價紅細(xì)胞氧化損傷的相關(guān)指標(biāo),其中Met Hb含量反應(yīng)胞內(nèi)血紅蛋白的狀態(tài),與紅細(xì)胞攜放氧能力相關(guān),紅細(xì)胞變形性等流變學(xué)指標(biāo)與膜氧化后流動性相關(guān)。本部分研究結(jié)果顯示:三種氧化劑作用紅細(xì)胞均能引起Met Hb水平升高,證明其均造成一定程度的氧化損傷。但是三種氧化劑對紅細(xì)胞流變學(xué)特性影響大不相同,其中Na NO2可上調(diào)紅細(xì)胞變形能力,這可能與其作為NO供體的特性有關(guān)。由此可見Na NO2作為氧化劑一方面可使紅細(xì)胞Met Hb含量升高,造成紅細(xì)胞氧化損傷;但另一方面,它又可改善紅細(xì)胞變形能力,對紅細(xì)胞起雙向調(diào)節(jié)的作用,其機(jī)制較為復(fù)雜,因此我們認(rèn)為Na NO2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化損傷模型不適用于后續(xù)的研究,故選擇PMS和H2O2作為主要氧化劑進(jìn)行后續(xù)的紅細(xì)胞氧化損傷模型制備。另外根據(jù)Met Hb含量確定后續(xù)研究中PMS作用濃度為50μM,H2O2作用濃度為8 m M。第二部分:丙酮酸鈉對紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用應(yīng)用第一部分篩選的氧化劑種類及濃度建立紅細(xì)胞氧化損傷模型,并驗(yàn)證丙酮酸鈉對紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。頸動脈采集大鼠血液,離心去除白細(xì)胞,獲得紅細(xì)胞重懸液。首先對丙酮酸鈉作用濃度進(jìn)行篩選(分組為5、10、20、50和100 m M),通過作用前后Met Hb、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)等的變化確定丙酮酸鈉合適的作用濃度。隨后觀察不同濃度丙酮酸鈉對紅細(xì)胞的保護(hù)作用。將紅細(xì)胞重懸液分為兩組:PMS模型組和H2O2模型組。其中每一模型組又設(shè)置不同的作用條件,包括:對照組、氧化損傷組、丙酮酸鈉不同濃度預(yù)處理組等。首先向丙酮酸鈉預(yù)處理組加入相應(yīng)濃度丙酮酸鈉,37°C作用30 min,隨后根據(jù)分組加入相應(yīng)氧化劑于37°C作用1h。檢測相關(guān)指標(biāo)變化,其中PMS組檢測指標(biāo)包括Met Hb、MDA、GSH、GSH/GSSG比率和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR);H2O2組檢測指標(biāo)有Met Hb、MDA、GSH。結(jié)果表明:不同濃度丙酮酸鈉作用紅細(xì)胞后,Met Hb無明顯升高,與對照組比無顯著差異(P0.05);MDA隨作用濃度升高明顯下降(P0.05),但在丙酮酸鈉為100 m M時回升;GSH含量隨作用濃度升高呈上升趨勢,但與對照組相比無顯著差異(P0.05),在丙酮酸鈉為100 m M時有所下降。結(jié)果提示,低濃度丙酮酸鈉對紅細(xì)胞無明顯副作用,100 m M的作用濃度下各指標(biāo)異常提示可能該濃度偏高。故確定丙酮酸鈉作用濃度為5、10、20、50 m M。使用篩選的濃度觀察丙酮酸鈉對紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明PMS作用紅細(xì)胞后,與對照組相比,Met Hb、MDA含量升高(P0.05),GSH、GSH/GSSG下降(P0.05),GR無明顯變化(P0.05)。丙酮酸鈉預(yù)處理可以顯著降低PMS誘導(dǎo)的MDA水平,且在濃度為20 m M和50 m M時與PMS損傷組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);還可升高GSH/GSSG比率,并呈劑量效應(yīng)關(guān)系,各個濃度處理后GSH/GSSG比率與PMS損傷組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);但丙酮酸鈉預(yù)處理對PMS引起的Met Hb和GSH變化無明顯影響(P0.05)。H2O2作用紅細(xì)胞后,與對照組相比,Met Hb、MDA顯著升高(P0.05),GSH顯著下降(P0.05)。丙酮酸鈉預(yù)處理可以顯著降低H2O2誘導(dǎo)的Met Hb和MDA水平,與H2O2損傷組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);同時能升高GSH水平,在丙酮酸鈉濃度為20 m M和50 m M時,與H2O2損傷組比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。小結(jié):通過實(shí)驗(yàn)選擇丙酮酸鈉作用濃度為5、10、20、50 m M進(jìn)行保護(hù)作用研究。丙酮酸鈉均能夠降低PMS和H2O2誘導(dǎo)的MDA含量,表明丙酮酸鈉對這兩種氧化劑造成的紅細(xì)胞氧化損傷均具有一定程度保護(hù)作用;但是丙酮酸鈉對PMS誘導(dǎo)的Met Hb升高無明顯影響,卻能降低H2O2誘導(dǎo)的Met Hb水平,這可能與兩種氧化劑不同的作用機(jī)制有關(guān),這也提示我們丙酮酸鈉在H2O2引起的紅細(xì)胞氧化損傷模型中保護(hù)作用較明顯。因此,在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選用H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷模型研究丙酮酸鈉對紅細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制。第三部分:丙酮酸鈉對紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用機(jī)制探討以H2O2造成的紅細(xì)胞氧化損傷模型為主要研究對象,探討丙酮酸鈉對紅細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用的機(jī)制。頸動脈采集大鼠血液,離心去除白細(xì)胞,獲得紅細(xì)胞重懸液。將紅細(xì)胞重懸液分為:對照組,即沒有任何處理;H2O2損傷組,即只進(jìn)行氧化損傷誘導(dǎo);保護(hù)組,即采用不同濃度丙酮酸鈉預(yù)處理后再誘導(dǎo)氧化損傷,丙酮酸鈉作用濃度分別為5、10、20、50 m M。首先向保護(hù)組加入相應(yīng)濃度丙酮酸鈉,37°C作用30 min,隨后向損傷組和保護(hù)組加入H2O2,于37°C作用1 h。檢測相關(guān)指標(biāo)變化,包括ROS生成量,紅細(xì)胞功能指標(biāo)P50,糖代謝指標(biāo)2,3-DPG(2,3-diphosphoglycerate)、ATP水平和Na+-K+ATP酶活力以及代謝關(guān)鍵酶乳酸脫氫酶(lactate dehydrohenase,LDH)活力。結(jié)果表明:與對照組相比,H2O2作用紅細(xì)胞后,ROS水平上升,2,3-DPG和P50下降,ATP含量下降,Na+-K+ATP酶和LDH活力受到抑制(P0.05)。丙酮酸鈉預(yù)處理可以減少ROS含量,在濃度為50 m M時與損傷組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);與損傷組相比,丙酮酸鈉濃度為10 m M和20 m M時可明顯恢復(fù)LDH活性(P0.05);各個濃度丙酮酸鈉預(yù)處理均可升高ATP水平(P0.05);濃度為20 m M和50 m M的丙酮酸鈉可明顯恢復(fù)Na+-K+ATP酶活力(P0.05),升高2,3-DPG水平(P0.05),還可提高P50(P0.05)。小結(jié):首先,丙酮酸鈉能夠抑制ROS生成,直接降低H2O2對紅細(xì)胞的損傷;其次,丙酮酸鈉能夠提高LDH活力,促進(jìn)紅細(xì)胞糖酵解途徑,恢復(fù)ATP水平,減輕紅細(xì)胞氧化損傷。丙酮酸在轉(zhuǎn)換為乳酸的過程中能夠升高NAD+/NADH,NAD+升高有助于2,3-DPG生成,因此我們認(rèn)為丙酮酸鈉可促進(jìn)2,3-DPG支路進(jìn)行,提高2,3-DPG產(chǎn)量。作為糖酵解途徑中一個側(cè)支循環(huán)的產(chǎn)物,2,3-DPG是調(diào)節(jié)血紅蛋白攜放氧功能的重要因素。2,3-DPG可與脫氧血紅蛋白結(jié)合,降低血紅蛋白對O2的親和力,增加氧的釋放。本實(shí)驗(yàn)也表明丙酮酸鈉預(yù)處理能夠升高2,3-DPG含量,從而升高P50,改善紅細(xì)胞功能,發(fā)揮紅細(xì)胞保護(hù)作用。丙酮酸鈉對紅細(xì)胞不同的糖代謝途徑起效濃度不一致,可能與各途徑在細(xì)胞中所占比例不同有關(guān)。綜上所述,本研究結(jié)果表明丙酮酸鈉對紅細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用,并且其可分別通過調(diào)節(jié)糖酵解途徑及2,3-DPG支路,改善紅細(xì)胞功能、減輕紅細(xì)胞氧化損傷。本研究可為紅細(xì)胞氧化損傷相關(guān)疾病的防治提供新的思路和理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：紅細(xì)胞 氧化損傷 丙酮酸鈉 糖代謝
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-11
• Abstract11-16
• 前言16-19
• 第一章 建立合適的紅細(xì)胞氧化損傷模型19-30
• 1.1 材料與方法19-20
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物19
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)器材19-20
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑20
• 1.1.4 主要溶液配制20
• 1.2 方法20-21
• 1.2.1 紅細(xì)胞樣品的獲取20
• 1.2.2 紅細(xì)胞的處理20-21
• 1.2.3 指標(biāo)測定21
• 1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析21
• 1.3 結(jié)果21-27
• 1.4 討論27-29
• 本章小結(jié)29-30
• 第二章 丙酮酸鈉對紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用30-43
• 2.1 材料與方法31-32
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動物31
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)器材31
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及藥品31-32
• 2.1.4 主要溶液配制32
• 2.2 方法32-36
• 2.2.1 紅細(xì)胞樣品的獲取32
• 2.2.2 丙酮酸鈉濃度的篩選32
• 2.2.3 丙酮酸鈉對紅細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用研究32-35
• 2.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析35-36
• 2.3 結(jié)果36-40
• 2.3.1 丙酮酸鈉濃度的篩選36-37
• 2.3.2 丙酮酸鈉對PMS引起的紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用研究37-39
• 2.3.3 丙酮酸鈉對H2O2引起的紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用研究39-40
• 2.4 討論40-42
• 本章小結(jié)42-43
• 第三章 丙酮酸鈉對紅細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用機(jī)制研究43-57
• 3.1 材料與方法43-45
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)動物43
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)器材43-44
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及藥品44
• 3.1.4 主要溶液配制44-45
• 3.2 方法45-49
• 3.2.1 紅細(xì)胞樣品的獲取45
• 3.2.2 丙酮酸鈉對紅細(xì)胞功能的改善作用及機(jī)制研究45-49
• 3.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析49
• 3.3 結(jié)果49-53
• 3.3.1 丙酮酸鈉對紅細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用機(jī)制研究49-51
• 3.3.2 丙酮酸鈉對紅細(xì)胞功能的保護(hù)作用51-53
• 3.4 討論53-56
• 本章小結(jié)56-57
• 總結(jié)57-59
• 參考文獻(xiàn)59-64
• 文獻(xiàn)綜述64-72
• 參考文獻(xiàn)69-72
• 個人簡歷72-73
• 致謝73

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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本文編號：768913