本文關(guān)鍵詞：XRCC3的表達(dá)對食管鱗癌細(xì)胞放療敏感性的影響及其機(jī)制研究

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【摘要】：目的:研究同源重組相關(guān)蛋白XRCC3的表達(dá)影響食管鱗狀細(xì)胞癌放療敏感性的分子機(jī)制。方法:1.采用RT-PCR及Western Blot法在m RNA和蛋白水平檢測XRCC3在正常食黏膜細(xì)胞與食管鱗癌細(xì)胞的表達(dá)水平。通過免疫組織化學(xué)檢測XRCC3在正常食管黏膜組織及食管鱗癌組織中的表達(dá)水平。采用免疫組化評分標(biāo)準(zhǔn)對60例食管鱗癌組織標(biāo)本中XRCC3的表達(dá)情況進(jìn)行評分。用單因素分析該60例患者一般情況(年齡、性別、TNM分期等)以及對放化療的敏感性與XRCC3表達(dá)水平的相關(guān)性。運(yùn)用單變量分析方法分析60例食管鱗癌患者XRCC3表達(dá)水平與疾病相關(guān)生存的相關(guān)性。采用多因素分析的統(tǒng)計學(xué)方法分析患者食管鱗癌組織XRCC3表達(dá)水平、患者對同步放化療反應(yīng)、N分期、M分期與患者疾病相關(guān)生存的相關(guān)性。2.將沉默XRCC3基因的質(zhì)粒psh RNA-XRCC3轉(zhuǎn)染至食管鱗癌TE-1細(xì)胞及Kyse30細(xì)胞,建立沉默XRCC3表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系,同時將過表達(dá)XRCC3基因的質(zhì)粒p CDH-XRCC3轉(zhuǎn)染至上述穩(wěn)定細(xì)胞系中,建立XRCC3回復(fù)表達(dá)組,并設(shè)立未轉(zhuǎn)染空白對照組,用Western Blot法檢測psh RNA-XRCC3的沉默效率和p CDH-XRCC3回復(fù)表達(dá)效率。3.檢測沉默XRCC3對克隆形成能力的影響。采用克隆形成實驗檢測沉默XRCC3組、回復(fù)XRCC3表達(dá)組以及空白對照組TE-1細(xì)胞和Kyse30細(xì)胞放療后的克隆形成能力,觀察放療對各組細(xì)胞克隆形成能力的影響。沉默XRCC3表達(dá)的荷瘤裸鼠移植瘤(TE-1細(xì)胞)在經(jīng)放療后,采用游標(biāo)卡尺動態(tài)檢測裸鼠移植瘤體積的變化。4.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測沉默XRCC3組、回復(fù)XRCC3表達(dá)組以及空白對照組TE-1細(xì)胞和Kyse30細(xì)胞經(jīng)不同劑量放療后的凋亡水平,同時用高倍顯微鏡觀察各組細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難情況。采用Western Blot法檢測各組放療前后凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-PARP和Cleaved-Casbase-3的表達(dá)水平,并檢測各組細(xì)胞同源重組修復(fù)相關(guān)蛋白XRCC2和Rad51.3的表達(dá)情況。5.采用免疫熒光法分別檢測沉默XRCC3組、回復(fù)XRCC3表達(dá)組以及空白對照組TE-1細(xì)胞和Kyse30細(xì)胞在放療前后端粒功能紊亂誘導(dǎo)形成的TIF數(shù)量與DNA損傷修復(fù)蛋白γ-H2AX的表達(dá)水平。結(jié)果:1.與食管正常黏膜細(xì)胞和黏膜組織相比,XRCC3在Kyse150、Kyse510、Kyse410、TE-1、Kyse30五種食管鱗癌細(xì)胞以及食管鱗癌組織中,在m RNA水平和蛋白水平都呈高表達(dá)。單因素分析發(fā)現(xiàn)XRCC3的表達(dá)與食管鱗癌患者的放化療敏感性相關(guān)。高表達(dá)XRCC3與患者放化療抵抗有關(guān)(P=0.002)。單變量分析顯示高表達(dá)XRCC3,疾病相關(guān)生存較差(P=0.017)。多因素分析發(fā)現(xiàn)XRCC3表達(dá)水平、放化療反應(yīng)以及M分期分別為食管鱗癌患者疾病相關(guān)生存的獨(dú)立預(yù)測因子(P=0.011、0.007、0.041)2.在TE-1和Kyse30細(xì)胞中,成功建立psh RNA-XRCC3及p CDH-XRCC3的穩(wěn)定細(xì)胞系,在體外實驗中psh RNA-XRCC3組可以明顯降低XRCC3的表達(dá)水平,而p CDH-XRCC3組恢復(fù)了XRCC3的表達(dá)(P0.05)。3.在體內(nèi)體外實驗中,沉默XRCC3的表達(dá)能夠增加食管鱗癌TE-1和Kyse30細(xì)胞的放療敏感性�？寺⌒纬蓪嶒烇@示:XRCC3表達(dá)水平對細(xì)胞克隆形成能力沒有影響,但經(jīng)放療后,psh RNA-XRCC3組克隆形成能力顯著下降(P0.01)。裸鼠移植成瘤實驗顯示:在放療后沉默XRCC3組與對照組相比,顯著增強(qiáng)放療對移植瘤生長的抑制效應(yīng)。4.沉默XRCC3的表達(dá)能夠促進(jìn)放療誘導(dǎo)食管鱗癌TE-1和Kyse30細(xì)胞的凋亡與有絲分裂災(zāi)難。與Control組和p CDH-XRCC3組(回復(fù)表達(dá)XRCC3組)相比,psh RNA-XRCC3組和IR組的細(xì)胞凋亡和有絲分裂災(zāi)難比率增加,且IR+psh RNA-XRCC3組的細(xì)胞在照射后48h,凋亡及有絲分裂災(zāi)難發(fā)生率顯著增加(P0.01)。psh RNA-XRCC3組與對照組相比,凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-PARP和Cleaved-Casbase-3表達(dá)水平有顯著的升高,而同源重組修復(fù)相關(guān)蛋白XRCC2和Rad51.3表達(dá)水平則有明顯降低。5.沉默XRCC3的表達(dá)能夠增強(qiáng)食管鱗癌TE-1和Kyse30細(xì)胞放療所誘導(dǎo)的DNA損傷及端粒功能紊亂。與Control組和p CDH-XRCC3組相比,psh RNA-XRCC3組的細(xì)胞在放射照射后48h,DNA損傷修復(fù)蛋白γ-H2AX和端粒功能紊亂誘導(dǎo)形成的TIF都顯著增加,說明沉默XRCC3后,放療顯著增加細(xì)胞DNA的損傷以及端粒的功能紊亂(P0.01)。結(jié)論:XRCC3通過增強(qiáng)放療誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)和(或)保護(hù)端粒的穩(wěn)定性,來增強(qiáng)食管鱗癌對放療的抵抗作用。XRCC3可能是食管鱗癌放療敏感性的預(yù)測因子,有望成為食管鱗癌放療的有效治療靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：食管鱗狀細(xì)胞癌 XRCC3 放療 端粒穩(wěn)定性 凋亡 有絲分裂災(zāi)難
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 縮略語/符號說明12-13
• 前言13-15
• 研究現(xiàn)狀、成果13-14
• 研究目的、方法14-15
• 1 對象和方法15-38
• 1.1 實驗材料15-18
• 1.1.1 病人及組織標(biāo)本15-16
• 1.1.2 細(xì)胞系16-18
• 1.2 實驗所需主要試劑及溶液的配制18-20
• 1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)所需18
• 1.2.2 其他實驗所需18-20
• 1.3 主要儀器設(shè)備20-21
• 1.4 實驗方法21-37
• 1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)（Cell culture）21-23
• 1.4.2 RT-PCR23-25
• 1.4.3 免疫印跡（Western Blot）25-30
• 1.4.4 免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry)30-31
• 1.4.5 穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建（Construction of stable cell lines）31-33
• 1.4.6 克隆形成實驗（Clonogenic survival assay）33-34
• 1.4.7 體內(nèi)裸鼠荷瘤生長實驗（In vivo tumor growth assay）34-35
• 1.4.8 流式細(xì)胞儀 Annexin-V/PI 雙標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡（Annexin-V-FITC?propidium iodide flow cytometry apoptosis assay）35-36
• 1.4.9 免疫熒光實驗（Immunofluoresence staining assay）36-37
• 1.5 統(tǒng)計學(xué)分析(Statistical analyses)37-38
• 2 結(jié)果38-46
• 2.1 XRCC3在食管鱗癌細(xì)胞和食管鱗癌組織中呈高表達(dá)38-39
• 2.2 高表達(dá)XRCC3與食管鱗癌患者放化療抵抗及不良預(yù)后有關(guān)39-41
• 2.3 在體內(nèi)體外實驗中，低表達(dá)XRCC3能夠增加食管鱗癌TE-1和Kyse30細(xì)胞的放療敏感性41-43
• 2.4 沉默XRCC3的表達(dá)能夠增強(qiáng)放療誘導(dǎo)的食管鱗癌TE-1和Kyse30細(xì)胞的凋亡和有絲分裂災(zāi)難43-45
• 2.5 沉默XRCC3的表達(dá)能夠增強(qiáng)放療所誘導(dǎo)食管鱗癌TE-1 和Kyse30細(xì)胞的DNA損傷及端粒功能紊亂45-46
• 3 討論46-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-53
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明53-54
• 綜述 DNA修復(fù)基因XRCC3作用機(jī)制及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究進(jìn)展54-63
• 綜述參考文獻(xiàn)59-63
• 致謝63-65
• 個人簡歷65

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本文編號：763527