本文關(guān)鍵詞：microRNA-639通過靶定ZEB1抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力

  更多相關(guān)文章： miR-639 肝細(xì)胞癌 ZEB1 遷移 侵襲 EMT

【摘要】：目的:肝癌是最為常見的原發(fā)性腫瘤之一,其發(fā)病率在惡性腫瘤中排名第五位,病死率排名第二。隨著肝癌病程的發(fā)展,其癌細(xì)胞易發(fā)生轉(zhuǎn)移,是肝癌難以治愈的,死亡率高的主要原因。肝癌的發(fā)生、發(fā)展與許多因素密切相關(guān),涉及細(xì)胞內(nèi)多種基因表達(dá)的改變。micro RNA(mi RNA)是內(nèi)源性非編碼小RNA分子,能與m RNA的非編碼序列互補(bǔ),介導(dǎo)m RNA的降解或抑制其翻譯,是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。已有研究表明mi RNA與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室前期工作證實(shí),micro RNA-639(mi R-639)在肝癌中表達(dá)下調(diào),并且抑制肝癌細(xì)胞的生長和增殖,在肝癌中發(fā)揮抑癌基因的功能。本課題進(jìn)一步探討mi R-639對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響,篩選其下游直接靶基因,探索mi R-639在肝癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌基因的生物學(xué)機(jī)制。并且結(jié)合mi R-639和其靶基因ZEB1的功能與腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲的生物學(xué)過程,深入探討了mi R-639調(diào)控肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的具體分子生物機(jī)制,以及可能的調(diào)控途徑。力求為研究肝癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。方法:1.利用Transwell小室以及matrigel模擬細(xì)胞基底膜,采用Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mi R-639對肝癌細(xì)胞系QGY-7703和Hep G2遷移和侵襲能力的影響。2.利用mi RBase Targets、Target Scan和Pic Tar等軟件,篩選mi R-639的靶基因,最終我們選擇ZEB1作為研究對象。3.設(shè)計(jì)并構(gòu)建帶有ZEB1 3’UTR的EGFP報告載體,利用熒光報告載體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mi R-639與ZEB1的靶定關(guān)系,并結(jié)合q RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)從m RNA水平和蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證了mi R-639對ZEB1調(diào)控關(guān)系。4.研究靶基因的功能,我們構(gòu)建了ZEB1的過表達(dá)和敲降質(zhì)粒,并通過Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)確證ZEB1能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞QGY-7703和Hep G2細(xì)胞的遷移和侵襲能力。然后我們通過對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的挽救實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證mi R-639是否通過直接調(diào)控靶基因ZEB1發(fā)揮對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)控作用。5.最后,我們利用Western blot技術(shù)檢測了mi R-639和ZEB1對肝癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化途徑的蛋白標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin和ICAM-1的影響,探索mi R-639是否通過靶定ZEB1調(diào)控EMT途徑。結(jié)果:過表達(dá)mi R-639抑制肝癌細(xì)胞QGY-7703和Hep G2的遷移和侵襲能力。生物信息學(xué)方法預(yù)測mi R-639能夠靶定ZEB1基因m RNA的3’UTR區(qū)域,熒光報告載體實(shí)驗(yàn)確證mi R-639直接靶定ZEB1,并且能夠從m RNA水平和蛋白質(zhì)水平負(fù)調(diào)控ZEB1的表達(dá)。mi R-639與靶基因的挽救實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了mi R-639對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用是通過負(fù)調(diào)控靶基因ZEB1實(shí)現(xiàn)的。Western blot結(jié)果表明mi R-639能夠上調(diào)E-cadherin的表達(dá),下調(diào)Vimentin和ICAM-1的表達(dá),抑制肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化,與其靶基因ZEB1對EMT途徑的作用相反。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)研究并證實(shí)了mi R-639通過負(fù)調(diào)控ZEB1基因來抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲,并且mi R-639對ZEB1基因的負(fù)調(diào)控作用,減弱了ZEB1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞EMT轉(zhuǎn)化的促進(jìn),最終mi R-639在肝癌細(xì)胞中表現(xiàn)為抑癌基因的功能。
【關(guān)鍵詞】：miR-639 肝細(xì)胞癌 ZEB1 遷移 侵襲 EMT
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語10-12
• 前言12-16
• 研究現(xiàn)狀、成果12-15
• 研究目的、方法15-16
• 一、miR-639在肝癌細(xì)胞中的作用研究16-29
• 1.1 材料和方法16-23
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料16-17
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法17-23
• 1.1.3 統(tǒng)計(jì)方法23
• 1.2 結(jié)果23-28
• 1.2.1 pri-miR-639和Antago-miR-639質(zhì)粒有效性的驗(yàn)證23-24
• 1.2.2 miR-639對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響24-25
• 1.2.3 miR-639對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響25-26
• 1.2.4 pAntago-miR-639對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響26-27
• 1.2.5 pAntago-miR-639對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響27-28
• 1.3 小結(jié)28-29
• 二、miR-639與ZEB1的靶定關(guān)系29-41
• 2.1 材料和方法29-36
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料29
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法29-36
• 2.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法36
• 2.2 結(jié)果36-40
• 2.2.1 miR-639候選靶基因的篩選36-37
• 2.2.2 驗(yàn)證ZEB1是miR-639的直接靶基因37-38
• 2.2.3 驗(yàn)證miR-639對ZEB1mRNA表達(dá)水平的影響38-39
• 2.2.4 驗(yàn)證miR-639對ZEB1蛋白表達(dá)水平的影響39-40
• 2.3 小結(jié)40-41
• 三、ZEB1在肝癌細(xì)胞中的作用研究41-51
• 3.1 材料和方法41-46
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料41
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法41-46
• 3.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法46
• 3.2 結(jié)果46-50
• 3.2.1 從mRNA表達(dá)水平檢測ZEB1過表達(dá)和敲降質(zhì)粒的有效性46-47
• 3.2.2 從蛋白質(zhì)表達(dá)水平檢測ZEB1過表達(dá)和敲降質(zhì)粒的有效性47
• 3.2.3 ZEB1對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響47-48
• 3.2.4 ZEB1對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響48-49
• 3.2.5 miR-639與ZEB1對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的挽救實(shí)驗(yàn)49-50
• 3.3 小結(jié)50-51
• 四、miR-639通過EMT途徑影響肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力51-56
• 4.1 材料和方法51-52
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料51
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)方法51-52
• 4.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法52
• 4.2 結(jié)果52-55
• 4.2.1 ZEB1對EMT途徑影響52-53
• 4.2.2 miR-639對EMT途徑影響53-55
• 4.3 小結(jié)55-56
• 討論56-59
• 全文結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明64-65
• 綜述 非編碼小RNA與肝癌65-78
• 綜述參考文獻(xiàn)73-78
• 致謝78

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