本文關(guān)鍵詞：CD20嵌合抗原受體修飾自體T細(xì)胞對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤的殺傷作用研究

  更多相關(guān)文章： 嵌合抗原受體 B細(xì)胞淋巴瘤 慢病毒載體 轉(zhuǎn)染

【摘要】：目的：B淋巴瘤細(xì)胞表達(dá)的CD20抗原是公認(rèn)的治療靶點(diǎn)。但CD20抗體血清半衰期短,易耐藥,不能將腫瘤細(xì)胞徹底殺滅。近期實(shí)驗(yàn)證實(shí)CD28、CD137可激活體外培養(yǎng)的T細(xì)胞,使其恢復(fù)體內(nèi)增殖能力和抗腫瘤能力。本課題將CD20抗體與CD28、CD137抗體組成嵌合抗原受體,轉(zhuǎn)染并激活自體T細(xì)胞,使其對(duì)淋巴瘤細(xì)胞同時(shí)具有靶向殺傷和免疫監(jiān)控作用。方法：利用基因合成技術(shù)合成CD20-28-137-TCR-ζ基因序列,送至基因測(cè)序公司進(jìn)行檢測(cè),比對(duì)基因序列圖譜,檢測(cè)基因合成的正確性。構(gòu)建慢病毒載體,將合成好的基因序列載入到慢病毒載體中。用COBE細(xì)胞單采機(jī)采集淋巴瘤患者的外周血細(xì)胞,用淋巴細(xì)胞分離液分離,采用培養(yǎng)CIK細(xì)胞的方法對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),加入CD3, IFN-γ, IL-2細(xì)胞因子,刺激T細(xì)胞增長(zhǎng),以得到較為純凈的目的T細(xì)胞。用之前構(gòu)建的高效穩(wěn)定的慢病毒載體轉(zhuǎn)染目的T細(xì)胞,合成CAR-T-20細(xì)胞,留作之后試驗(yàn)檢測(cè)。采用LDH法測(cè)定CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞外毒性。將CAR細(xì)胞與淋巴瘤細(xì)胞按照一定的比例混合,檢測(cè)CAR-T細(xì)胞對(duì)淋巴瘤細(xì)胞是否具有殺傷作用,并判斷CAR-T與淋巴細(xì)胞具有最大殺傷作用的比例為多少。構(gòu)建淋巴瘤小鼠模型,將構(gòu)建好的CAR-T細(xì)胞注入小鼠體內(nèi),觀察記錄小鼠體內(nèi)腫瘤的大小變化,并作出記錄進(jìn)行統(tǒng)計(jì),以判斷CAR-T在體內(nèi)對(duì)淋巴瘤的殺傷作用。結(jié)果：經(jīng)過基因測(cè)序檢測(cè)合成的CD20-28-137-TCR-ζ基因與目標(biāo)基因序列一致,長(zhǎng)度相同,說明基因構(gòu)建成功。構(gòu)建后的慢病毒載體,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶清晰,位置相同,說明CA20-28-137-TCR-ζ基因被成功載入慢病毒載體中。之后對(duì)慢病毒載體進(jìn)行包裝和滴度測(cè)定,通過GFP檢測(cè)觀察慢病毒載體被成功包裝,慢病毒的滴度經(jīng)過計(jì)算結(jié)果為8.25×108TU/ML。用慢病毒載體轉(zhuǎn)染目的T細(xì)胞,根據(jù)轉(zhuǎn)染前后目的T細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量得出,轉(zhuǎn)染效率為56%。LDH試驗(yàn)共按照四個(gè)比例進(jìn)行比對(duì),比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CAR-T細(xì)胞與淋巴瘤細(xì)胞的比例在10：1的情況下,對(duì)淋巴瘤的殺傷作用最大。構(gòu)建的小鼠模型按照每組10只,分成3個(gè)組,分別是空白對(duì)照組,陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到的數(shù)據(jù)顯示陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)具有明顯抑制作用,陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的腫瘤生長(zhǎng)速度差距不大。結(jié)論：體外實(shí)驗(yàn)充分證實(shí)CAR-T細(xì)胞對(duì)淋巴瘤具有殺傷作用,且在CAR-T細(xì)胞與淋巴瘤細(xì)胞比值在10：1的情況下,殺傷作用最大。體內(nèi)試驗(yàn)初步證明了CAR-T細(xì)胞對(duì)淋巴瘤的生長(zhǎng)具有一定抑制作用。綜上所述,初步證明CAR-T細(xì)胞對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤的治療具有一定的治療效果。
【關(guān)鍵詞】：嵌合抗原受體 B細(xì)胞淋巴瘤 慢病毒載體 轉(zhuǎn)染
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.1
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-12
• 緒論12-20
• (1) B淋巴瘤的發(fā)病率及國(guó)內(nèi)外的治療現(xiàn)狀12-13
• (2) 淋巴瘤藥物的治療缺陷13
• (3) 細(xì)胞免疫對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤的作用13-14
• (4) 特異性抗原CD2014-15
• (5) 共刺激分子CD28,CD13715-16
• (6) 嵌合抗原受體CAR及其研究進(jìn)展16-17
• (7) 近些年國(guó)內(nèi)外取得的研究進(jìn)展和臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果17-18
• (8) 臨床應(yīng)用中出現(xiàn)的不良反應(yīng)與風(fēng)險(xiǎn)18-19
• (9) 研究設(shè)想及主要研究方法19-20
• 縮略詞表20-22
• 材料與方法22-32
• 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物22
• 二、主要儀器與設(shè)備22-23
• 三、主要實(shí)驗(yàn)試劑及材料23-24
• 四、實(shí)驗(yàn)方法24-32
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法32-33
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-42
• 1. T細(xì)胞的培養(yǎng)33-34
• 2. 慢病毒載體的構(gòu)建34
• 3. 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)34-35
• 4. 測(cè)序比對(duì)驗(yàn)證結(jié)果35-36
• 5. 慢病毒載體的包裝結(jié)果檢測(cè)36-37
• 6. 病毒滴度測(cè)試結(jié)果37-39
• 7. 慢病毒轉(zhuǎn)染目的T細(xì)胞39
• 8. LDH檢測(cè)細(xì)胞外毒性39-40
• 9. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)40-42
• 討論42-47
• 1. CAR-T的結(jié)構(gòu)與功能42-44
• 2. 慢病毒載體44-45
• 3. 臨床應(yīng)用及展望45-47
• 全文結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-55
• 綜述55-64
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 致謝64-66
• 附錄A 攻讀碩士期間發(fā)表論文情況66-67
• 附錄B 其他要說明的內(nèi)容67

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