本文關鍵詞：CD20嵌合抗原受體修飾自體T細胞對B細胞淋巴瘤的殺傷作用研究

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【摘要】：目的：B淋巴瘤細胞表達的CD20抗原是公認的治療靶點。但CD20抗體血清半衰期短,易耐藥,不能將腫瘤細胞徹底殺滅。近期實驗證實CD28、CD137可激活體外培養(yǎng)的T細胞,使其恢復體內增殖能力和抗腫瘤能力。本課題將CD20抗體與CD28、CD137抗體組成嵌合抗原受體,轉染并激活自體T細胞,使其對淋巴瘤細胞同時具有靶向殺傷和免疫監(jiān)控作用。方法：利用基因合成技術合成CD20-28-137-TCR-ζ基因序列,送至基因測序公司進行檢測,比對基因序列圖譜,檢測基因合成的正確性。構建慢病毒載體,將合成好的基因序列載入到慢病毒載體中。用COBE細胞單采機采集淋巴瘤患者的外周血細胞,用淋巴細胞分離液分離,采用培養(yǎng)CIK細胞的方法對淋巴細胞進行培養(yǎng),加入CD3, IFN-γ, IL-2細胞因子,刺激T細胞增長,以得到較為純凈的目的T細胞。用之前構建的高效穩(wěn)定的慢病毒載體轉染目的T細胞,合成CAR-T-20細胞,留作之后試驗檢測。采用LDH法測定CAR-T細胞的細胞外毒性。將CAR細胞與淋巴瘤細胞按照一定的比例混合,檢測CAR-T細胞對淋巴瘤細胞是否具有殺傷作用,并判斷CAR-T與淋巴細胞具有最大殺傷作用的比例為多少。構建淋巴瘤小鼠模型,將構建好的CAR-T細胞注入小鼠體內,觀察記錄小鼠體內腫瘤的大小變化,并作出記錄進行統(tǒng)計,以判斷CAR-T在體內對淋巴瘤的殺傷作用。結果：經過基因測序檢測合成的CD20-28-137-TCR-ζ基因與目標基因序列一致,長度相同,說明基因構建成功。構建后的慢病毒載體,經瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶清晰,位置相同,說明CA20-28-137-TCR-ζ基因被成功載入慢病毒載體中。之后對慢病毒載體進行包裝和滴度測定,通過GFP檢測觀察慢病毒載體被成功包裝,慢病毒的滴度經過計算結果為8.25×108TU/ML。用慢病毒載體轉染目的T細胞,根據轉染前后目的T細胞的細胞數量得出,轉染效率為56%。LDH試驗共按照四個比例進行比對,比對結果發(fā)現在CAR-T細胞與淋巴瘤細胞的比例在10：1的情況下,對淋巴瘤的殺傷作用最大。構建的小鼠模型按照每組10只,分成3個組,分別是空白對照組,陰性對照組和陽性對照組,實驗結果觀察到的數據顯示陽性對照組對腫瘤的生長具有明顯抑制作用,陰性對照組和空白對照組的腫瘤生長速度差距不大。結論：體外實驗充分證實CAR-T細胞對淋巴瘤具有殺傷作用,且在CAR-T細胞與淋巴瘤細胞比值在10：1的情況下,殺傷作用最大。體內試驗初步證明了CAR-T細胞對淋巴瘤的生長具有一定抑制作用。綜上所述,初步證明CAR-T細胞對B細胞淋巴瘤的治療具有一定的治療效果。
【關鍵詞】：嵌合抗原受體 B細胞淋巴瘤 慢病毒載體 轉染
【學位授予單位】：昆明理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R733.1
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-12
• 緒論12-20
• (1) B淋巴瘤的發(fā)病率及國內外的治療現狀12-13
• (2) 淋巴瘤藥物的治療缺陷13
• (3) 細胞免疫對B細胞淋巴瘤的作用13-14
• (4) 特異性抗原CD2014-15
• (5) 共刺激分子CD28,CD13715-16
• (6) 嵌合抗原受體CAR及其研究進展16-17
• (7) 近些年國內外取得的研究進展和臨床實驗結果17-18
• (8) 臨床應用中出現的不良反應與風險18-19
• (9) 研究設想及主要研究方法19-20
• 縮略詞表20-22
• 材料與方法22-32
• 一、實驗動物22
• 二、主要儀器與設備22-23
• 三、主要實驗試劑及材料23-24
• 四、實驗方法24-32
• 統(tǒng)計學方法32-33
• 實驗結果33-42
• 1. T細胞的培養(yǎng)33-34
• 2. 慢病毒載體的構建34
• 3. 瓊脂糖凝膠電泳檢測34-35
• 4. 測序比對驗證結果35-36
• 5. 慢病毒載體的包裝結果檢測36-37
• 6. 病毒滴度測試結果37-39
• 7. 慢病毒轉染目的T細胞39
• 8. LDH檢測細胞外毒性39-40
• 9. 動物實驗40-42
• 討論42-47
• 1. CAR-T的結構與功能42-44
• 2. 慢病毒載體44-45
• 3. 臨床應用及展望45-47
• 全文結論47-48
• 參考文獻48-55
• 綜述55-64
• 參考文獻60-64
• 致謝64-66
• 附錄A 攻讀碩士期間發(fā)表論文情況66-67
• 附錄B 其他要說明的內容67

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