本文關(guān)鍵詞：miR-139-5p通過靶向NOTCH-1增加結(jié)直腸癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的化療敏感性

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【摘要】：腫瘤耐藥是指腫瘤細(xì)胞對化療藥物具有耐受性的現(xiàn)象,它不僅使藥物療效減弱,而且常常導(dǎo)致腫瘤化療失敗,是影響腫瘤復(fù)發(fā)甚至轉(zhuǎn)移的重要因素。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是目前結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)治療的一線藥物,它通過干擾細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA的合成抑制腫瘤的生長。雖然在治療初期,大部分CRC細(xì)胞對5-FU敏感,腫瘤體積出現(xiàn)減小,但是由于腫瘤耐藥的產(chǎn)生,5-FU并不能清除所有腫瘤細(xì)胞,5-FU耐藥已經(jīng)嚴(yán)重影響CRC的治療,因此,鑒定出與5-FU耐藥相關(guān)的生物分子對提高CRC的化療效果十分關(guān)鍵。微小RNA(micro RNA,miRNA)是一類長度為20-25個核苷酸的非編碼RNA,它通過靶向基因的3’UTR在轉(zhuǎn)錄后水平抑制所調(diào)控基因的表達(dá),miRNAs的異常表達(dá)幾乎在所有腫瘤中被檢測到,影響了腫瘤的增殖、凋亡、遷移與侵襲等過程。miR-139基因位于11q13.4,其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)加工可產(chǎn)生miR-139-5p和miR-139-3p兩個成熟miRNA分子。我們先前的研究表明miR-139-5p在CRC中發(fā)揮著潛在的“抑癌基因”功能,miR-139-5p的低表達(dá)促進(jìn)CRC細(xì)胞的遷移和侵襲,并且導(dǎo)致CRC病人的不良預(yù)后,但是,miR-139-5p與CRC耐藥之間的關(guān)聯(lián)并沒有被系統(tǒng)地闡明。本研究中我們收集了未接受放化療的CRC組織20例和接受了以5-FU為基礎(chǔ)的新輔助化療的CRC組織10例,并建立了對5-FU耐藥的CRC細(xì)胞株(HCT-8/5-FU、HCT-116/5-FU)和miR-139-5p穩(wěn)定過表達(dá)的CRC細(xì)胞株(HCT-116-miR-139-5p、LoVo-miR-139-5p);利用qRT-PCR檢測5-FU誘導(dǎo)后miR-139-5p的表達(dá)情況,并用CCK-8實(shí)驗(yàn)確認(rèn)miR-139-5p過表達(dá)對CRC細(xì)胞耐受5-FU的影響;接著用熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)、免疫印跡和功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)分析miR-139-5p影響CRC耐藥的分子機(jī)制。結(jié)果表明,miR-139-5p在接受了5-FU為基礎(chǔ)的新輔助化療CRC病人腫瘤組織中或5-FU耐藥的CRC細(xì)胞中均顯著低表達(dá);過表達(dá)miR-139-5p通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡增加CRC細(xì)胞對5-FU的化療敏感性;熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)、功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)和免疫印跡研究顯示,miR-139-5p增加CRC細(xì)胞對5-FU敏感性的分子機(jī)制是:靶向NOTCH-1,抑制其下游耐藥相關(guān)基因MRP-1和BCL-2的表達(dá);此外,NOTCH-1在5-FU耐藥的CRC細(xì)胞中高表達(dá),過表達(dá)miR-139-5p通過下調(diào)NOTCH-1逆轉(zhuǎn)CRC細(xì)胞對5-FU耐藥。本研究揭示了miR-139-5p/NTOCH-1信號通路在調(diào)控CRC細(xì)胞對5-FU化療敏感性中的重要作用,其有望成為克服CRC細(xì)胞對5-FU耐藥的新靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)直腸癌 miR-139-5p 化療耐藥 NOTCH-1 5-氟尿嘧啶
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 縮略詞8-9
• 第一章 緒論9-16
• 1.1 結(jié)直腸癌概況9
• 1.2 腫瘤耐藥9-10
• 1.3 Micro RNAs10-12
• 1.3.1 miRNA與腫瘤11
• 1.3.2 miRNA與腫瘤耐藥11-12
• 1.3.3 miRNA在腫瘤診療中的應(yīng)用12
• 1.4 miR1395p與腫瘤研究進(jìn)展12-14
• 1.4.1 miR1395p與腫瘤增殖12-13
• 1.4.2 miR1395p與腫瘤細(xì)胞周期13
• 1.4.3 miR1395p與腫瘤細(xì)胞凋亡13
• 1.4.4 miR1395p與腫瘤遷移及侵襲13-14
• 1.4.5 miR1395p與腫瘤耐藥14
• 1.5 本課題研究的意義14
• 1.6 本課題研究的內(nèi)容14-16
• 第二章 miR1395p對結(jié)直腸癌細(xì)胞耐受 5-FU的影響16-28
• 2.1 引言16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料16-18
• 2.2.1 結(jié)直腸癌組織16
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株16-17
• 2.2.3 主要實(shí)驗(yàn)材料17
• 2.2.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器17-18
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法18-22
• 2.3.1 結(jié)直腸癌組織收集及病理信息處理18
• 2.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代18
• 2.3.3 細(xì)胞凍存及復(fù)蘇18-19
• 2.3.4 耐藥細(xì)胞的誘導(dǎo)19
• 2.3.5 TRIzol法提取組織或細(xì)胞中的RNA19
• 2.3.6 將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA19-20
• 2.3.7 探針法qPCR檢測miR1395p的表達(dá)20
• 2.3.8 慢病毒載體包裝20-21
• 2.3.9 慢病毒感染21
• 2.3.10 CCK-8 檢測藥敏21
• 2.3.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡21-22
• 2.3.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析22
• 2.4 結(jié)果與討論22-26
• 2.4.1 誘導(dǎo) 5-FU耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞22-23
• 2.4.2 構(gòu)建miR1395p過表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞株23
• 2.4.3 -FU化療后的結(jié)直腸癌組織或細(xì)胞中miR1395p的表達(dá)23-24
• 2.4.4 miR1395p對結(jié)直腸癌細(xì)胞耐受 5-FU的影響24-26
• 2.4.5 miR1395p對 5-FU誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響26
• 2.5 本章小結(jié)26-28
• 第三章 miR1395p影響結(jié)直腸癌細(xì)胞對 5-FU耐受性的機(jī)制研究28-41
• 3.1 引言28
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料28-30
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株28
• 3.2.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑28-29
• 3.2.3 引物及si RN A序列29-30
• 3.2.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器30
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法30-35
• 3.3.1 Western Blot相關(guān)試劑的配置30-31
• 3.3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌31
• 3.3.3 大腸桿菌挑克隆實(shí)驗(yàn)31
• 3.3.4 質(zhì)粒抽提31-32
• 3.3.5 熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)32
• 3.3.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)32
• 3.3.7 實(shí)時熒光定量PCR32-33
• 3.3.8 CCK-8 實(shí)驗(yàn)33
• 3.3.9 蛋白提取與濃度測定33-34
• 3.3.10 免疫印跡34-35
• 3.3.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析35
• 3.4 結(jié)果與討論35-40
• 3.4.1 miR1395p靶向NOTCH-1 的 3’UTR抑制其表達(dá)35-36
• 3.4.2 miR1395p通過NOTCH-1 影響結(jié)直腸癌細(xì)胞對 5-FU的耐受性36-37
• 3.4.3 miR1395p抑制NOTCH-1 下游分子MRP-1 和BCL-2 的表達(dá)37-39
• 3.4.4 miR1395p/NOTCH-1 通路逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞對 5-FU的耐藥39-40
• 3.5 本章小結(jié)40-41
• 主要結(jié)論與展望41-42
• 主要結(jié)論41
• 展望41-42
• 致謝42-43
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 附錄: 作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文47

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本文編號：727806