發(fā)布時(shí)間：2017-08-19 10:14

  本文關(guān)鍵詞：膠質(zhì)瘤干細(xì)胞誘發(fā)腫瘤免疫炎性微環(huán)境相關(guān)動(dòng)物模型的研究

  更多相關(guān)文章： 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞 腫瘤免疫炎性微環(huán)境 雙色熒光示蹤動(dòng)物模型

【摘要】：背景與目的:腫瘤微環(huán)境是指腫瘤細(xì)胞與宿主組織和細(xì)胞之間形成的相生相克的微生態(tài)環(huán)境。盡管近年有關(guān)腫瘤微環(huán)境的研究進(jìn)展迅速,但所得數(shù)據(jù)受倫理學(xué)限止,仍然主要來(lái)源于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型而非人體,因此搭建模擬性高的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型平臺(tái)還是腫瘤學(xué)研究者十分關(guān)注的重要問(wèn)題。就腫瘤免疫炎性微環(huán)境而言,建立人腫瘤動(dòng)物模型的要求比建立普通動(dòng)物模型的要求更高,必須能確切地反映出那些被腫瘤細(xì)胞重構(gòu)的腫瘤組織和腫瘤邊緣的宿主源性免疫炎性細(xì)胞的來(lái)龍去脈,最好還要搞清楚這些細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所起的相生相克作用。基于上述原因,本文旨在本課題組早先建立表達(dá)紅色熒光蛋白(RFP)的人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的裸小鼠(RFP+/GFP+雙色熒光示蹤)模型的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討膠質(zhì)瘤干細(xì)胞誘發(fā)腫瘤免疫炎性微環(huán)境的相關(guān)問(wèn)題,尤其是高壓氧如何改變腫瘤微環(huán)境的一些情況。材料與方法:接種用的人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞SU3和轉(zhuǎn)RFP基因的SU3-RFP,表達(dá)綠色熒光蛋白的NC和Balbc裸小鼠,接種腫瘤細(xì)胞用的套管針和維持SPF級(jí)的高壓氧治療系統(tǒng)-HBOT/IVC都是本課題組研制的。接種腫瘤細(xì)胞的方法,根據(jù)接種部位的不同而有差別,若是腦內(nèi)原位接種,則借助立體定向儀,經(jīng)鉆顱孔緩慢注射;若是皮下接種,則用套管針將腫瘤組織塊或用青霉素皮試注射器將腫瘤細(xì)胞混懸液注入前肢腋下或足掌;若是肝臟接種,則須右肋緣切開,將腫瘤細(xì)胞通過(guò)微量泵緩慢注入肝組織內(nèi);若是腹腔接種,用青霉素皮試注射器將腫瘤細(xì)胞直接推注入腹腔即可。至于接種腫瘤細(xì)胞的量,根據(jù)接種部位和實(shí)驗(yàn)需要觀察的指標(biāo)而定,若是皮下接種腫瘤組織塊,一般用1-3 mm3,細(xì)胞混懸液為106-107個(gè)細(xì)胞/0.5 ml培養(yǎng)液;若是腦和肝內(nèi)接種,一般用細(xì)胞混懸液105個(gè)細(xì)胞/10-15μl培養(yǎng)液。至于腫瘤免疫炎性微環(huán)境觀察,都需取移植瘤,必要時(shí)還要包括腫瘤邊緣組織做冰凍切片和常規(guī)石蠟切片后在白光和熒光顯微鏡下觀察表達(dá)GFP的細(xì)胞分布,通過(guò)ipps6.0軟件量化分析其表達(dá)。若要鑒定在腫瘤及邊緣組織顯示gfp細(xì)胞中的免疫炎性細(xì)胞比例,則必須要用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)這些細(xì)胞固有的標(biāo)志蛋白。當(dāng)然,也可通過(guò)組織消化后的混懸液用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定比例,或采用分離收集培養(yǎng)等方法隨實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌右赃x擇。為了觀察高壓氧對(duì)腫瘤的影響,將皮下接種su3的裸小鼠放置在hbot/ivc裝置內(nèi)進(jìn)行高壓氧治療,每天一次,每次100分鐘,連續(xù)21天,而單獨(dú)化療藥acnu組小鼠給予腹腔注射acnu30mg/kg,每周一次,共3次,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取出腫瘤組織后進(jìn)行稱重。用微電極測(cè)定腫瘤組織內(nèi)的氧含量。結(jié)果與分析:在腦內(nèi)移植瘤組織中,光鏡下可見(jiàn)腫瘤組織出血、壞死和血管增生,腫瘤細(xì)胞呈侵襲性生長(zhǎng)的惡性表型。在熒光顯微鏡下,能清楚地可見(jiàn)發(fā)紅色熒光的腫瘤細(xì)胞、發(fā)綠色熒光的宿主細(xì)胞和rfp/gfp雙陽(yáng)性的黃色細(xì)胞,在腫瘤壞死灶中和腫瘤邊緣見(jiàn)有大量綠色的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。在皮下移植瘤組織中,可見(jiàn)腫瘤微環(huán)境相關(guān)蛋白和宿主髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derivedsuppressorcells,mdsc)的標(biāo)記物包括hif-1α、tnf-α、ki67、cd68和cd11b的高表達(dá),在移植瘤間質(zhì)中,也可見(jiàn)有較多的gfp+、cd68+和cd11b+細(xì)胞。移植瘤經(jīng)高壓氧治療后,腫瘤重量減輕,尤其與化療藥acnu合用的腫瘤重量更輕。在腹腔移植瘤組織的病理切片上,熒光顯微鏡下可見(jiàn)腫瘤結(jié)節(jié)中包含了rfp+紅色細(xì)胞、gfp+綠色細(xì)胞及rfp+/gfp+的黃色細(xì)胞。在將腫瘤結(jié)節(jié)再培養(yǎng)后,gfp+細(xì)胞可惡性轉(zhuǎn)化為高表達(dá)cd68的癌細(xì)胞。在足掌移植瘤近心端的腫瘤邊緣組織,光鏡下可見(jiàn)到腫瘤細(xì)胞核深染,異形性明顯,核分裂常見(jiàn),細(xì)胞排列密集,而在熒光鏡下清晰地可見(jiàn)移植瘤組織中存在來(lái)源于循環(huán)血液的免疫炎性細(xì)胞。在肝移植瘤組織中,光鏡下可見(jiàn)su3細(xì)胞在異位的肝組織內(nèi)排列密集,核大、深染,并向周圍正常肝組織侵襲生長(zhǎng)。熒光鏡下可見(jiàn)有綠色宿主細(xì)胞與紅色腫瘤細(xì)胞的交織存在,其中包括腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associatedmacrophages,tam)。共聚焦顯微鏡下可進(jìn)一步清楚地看到這兩類細(xì)胞發(fā)生融合或吞噬的黃色細(xì)胞。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)到的紅、綠和黃色細(xì)胞分別為73.65%、19.56%和6.79%。這些黃色細(xì)胞單克隆化后獲得具有無(wú)限增殖能力的b4、b9和b10細(xì)胞,b4細(xì)胞可表達(dá)rfp/gfp,而b9和b10細(xì)胞僅表達(dá)gfp。b4細(xì)胞還表達(dá)cd1a、cd83和cd86等樹突狀細(xì)胞的分子標(biāo)記蛋白,B9和B10細(xì)胞可分別表達(dá)CD68、F4/80和FAP-α、α-SMA、S100等巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的分子標(biāo)記蛋白,經(jīng)病理診斷它們均為惡性腫瘤細(xì)胞。采用微電極測(cè)得移植瘤組織中氧含量,在常態(tài)下的頭皮下移植瘤中的平均氧含量為(28.93±8.06)mmol/L,腦內(nèi)移植瘤的平均氧含量為(47.46±15.96)mmol/L。經(jīng)HBO治療后,腦內(nèi)移植瘤在治療出窗時(shí)的平均氧含量增加為(86.61±10.91)mmol/L,與前者相比有顯著差異(P0.01)。HBO治療后的免疫炎性細(xì)胞明顯減少。結(jié)論:(1)本課題組所建的RFP+/GFP+雙色熒光分別示蹤人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和宿主組織細(xì)胞的模型,與傳統(tǒng)人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞移植普通裸小鼠模型相比,其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)除了依賴熒光顯微鏡就可以區(qū)別出腫瘤微環(huán)境中哪些是腫瘤細(xì)胞,哪些是腫瘤間質(zhì)細(xì)胞外,還能界定出RFP+/GFP+共定位在一個(gè)細(xì)胞上的黃色細(xì)胞,即是腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞發(fā)生了融合的細(xì)胞;(2)基于腫瘤免疫炎性反應(yīng)是腫瘤局部的全身性反應(yīng),而且參與反應(yīng)的細(xì)胞,主要來(lái)自骨髓中的髓源性抑制細(xì)胞,因此腫瘤細(xì)胞接種部位相對(duì)不重要,重要的是如何鑒定和量化這些免疫炎性細(xì)胞;(3)RFP+/GFP+的人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞移植瘤模型,對(duì)研究腫瘤微環(huán)境而言,可進(jìn)一步用于腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、播散和轉(zhuǎn)移等起正面或負(fù)面影響、以及腫瘤微環(huán)境細(xì)胞自身惡性轉(zhuǎn)化及其耐放化療等多方面的研究;(4)通過(guò)本模型證明,HBO治療可改善腫瘤微環(huán)境乏氧而抑制腫瘤免疫炎癥反應(yīng)來(lái)提高膠質(zhì)瘤化療的敏感性。
【關(guān)鍵詞】：膠質(zhì)瘤干細(xì)胞 腫瘤免疫炎性微環(huán)境 雙色熒光示蹤動(dòng)物模型
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 研究背景12-15
• 材料與方法15-19
• 結(jié)果19-26
• 討論26-29
• 小結(jié)29-30
• 參考文獻(xiàn)30-35
• 綜述:高壓氧聯(lián)合放化療治療腫瘤的研究現(xiàn)狀35-44
• 參考文獻(xiàn)39-44
• 縮寫詞表44-45
• 攻讀碩士學(xué)位期間公開發(fā)表的論文45-46
• 致謝46-47

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本文編號(hào)：700137