本文關(guān)鍵詞：CSN復(fù)合物在ATRA誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化中的作用及其機(jī)制研究

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【摘要】：研究目的:全反式維甲酸(ATRA)是第一個(gè)成功應(yīng)用于白血病治療的誘導(dǎo)分化藥物,能夠通過(guò)降解PML-RARα融合蛋白特異性誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)細(xì)胞分化成熟,因此已成為臨床上治療APL的首選藥物。但至今為止,ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化的作用機(jī)制仍未得到系統(tǒng)闡述。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道,維甲酸誘導(dǎo)基因G(RIG-G)可與COP9信號(hào)復(fù)合體(CSN)亞基CSN5相互作用,導(dǎo)致CSN復(fù)合物破壞并抑制其功能,提示CSN可能參與ATRA誘導(dǎo)的細(xì)胞分化;但是,其相關(guān)性研究仍未見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究將重點(diǎn)研究CSN在ATRA誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化過(guò)程中的作用,并探討其可能的作用機(jī)制。具體研究?jī)?nèi)容分為三個(gè)部分:1)闡明CSN在ATRA誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化過(guò)程中的變化情況;2)研究ATRA誘導(dǎo)分化中CSN-CRLs信號(hào)通路的變化;3)探討CSN-CRLs信號(hào)通路調(diào)控PML-RARα自噬降解的分子機(jī)制。研究方法:1)選用人白血病細(xì)胞株NB4細(xì)胞為研究對(duì)象,以ATRA處理來(lái)考察ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化過(guò)程中CSN的表達(dá)情況:應(yīng)用吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;細(xì)胞經(jīng)CD11b抗體孵育后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分化抗原CD11b表達(dá);應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中CSN各亞基m RNA水平變化;應(yīng)用Western blot檢測(cè)CSN蛋白水平的變化。同時(shí)應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)11例APL初診患者和15例非血液疾病患者骨髓細(xì)胞中CSN3和CSN5的表達(dá)情況。2)選用人白血病細(xì)胞株NB4細(xì)胞為研究對(duì)象,采用Western blot檢測(cè)ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化過(guò)程中CSN-CRLs信號(hào)通路中CRLs支架蛋白cullin蛋白、底物識(shí)別蛋白及下游靶蛋白DEPTOR、DAPK1等的表達(dá)情況。3)選用人白血病細(xì)胞株NB4細(xì)胞為研究對(duì)象,應(yīng)用Western blot和免疫熒光法檢測(cè)ATRA誘導(dǎo)分化中細(xì)胞內(nèi)自噬水平變化;選用293T細(xì)胞為瞬時(shí)表達(dá)宿主,共轉(zhuǎn)染DAPK1和PML-RARα,通過(guò)Western blot檢測(cè)分析DAPK1對(duì)PML-RARα蛋白的影響;分別以蛋白酶體抑制劑MG132和自噬抑制劑3-MA處理細(xì)胞進(jìn)一步比較觀察PML-RARα蛋白表達(dá)情況。研究結(jié)果:1)吉姆薩染色結(jié)果表明ATRA作用72小時(shí)后,NB4細(xì)胞分化為成熟粒細(xì)胞。同時(shí),經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞分化特異性抗原CD11b的表達(dá),結(jié)果顯示ATRA能夠誘導(dǎo)NB4細(xì)胞發(fā)生分化,且呈時(shí)間依賴(lài)性變化。Western blot及RT-PCR等檢測(cè)結(jié)果顯示,ATRA作用后,CSN復(fù)合物及各亞基表達(dá)水平均明顯下調(diào),且與細(xì)胞分化進(jìn)程相一致。此外,通過(guò)RT-PCR對(duì)臨床患者進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)CSN3和CSN5在APL患者骨髓中的含量明顯高于非白血病患者;經(jīng)ATRA化療緩解后,APL患者的CSN3和CSN5的m RNA表達(dá)水平均明顯下降。進(jìn)一步提示ATRA可以抑制CSN復(fù)合物的表達(dá)。2)鑒于CSN復(fù)合物在泛素蛋白酶體調(diào)節(jié)中的重要作用,進(jìn)一步檢測(cè)CSN-CRLs信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的變化。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,ATRA作用后,NB4細(xì)胞中CRLs支架蛋白cullin1和cullin3蛋白及其底物識(shí)別蛋白Skp2、βTr CP與KLHL20的表達(dá)都顯著下降;同時(shí),其下游靶蛋白DEPTOR、p27與DAPK1表達(dá)明顯上調(diào)。這些結(jié)果表明CSN-CRLs-E3信號(hào)通路可能在APL發(fā)病以及ATRA誘導(dǎo)分化中發(fā)揮重要作用。3)由于DEPTOR、DAPK1等蛋白分子在細(xì)胞自噬調(diào)控中發(fā)揮著重要作用,而研究發(fā)現(xiàn)分化誘導(dǎo)劑ATRA可以增強(qiáng)APL細(xì)胞的自噬水平,并能促進(jìn)PML/RARα蛋白降解。為了探討DAPK1等蛋白的累積是否與ATRA誘導(dǎo)的PML/RARα蛋白的自噬降解有關(guān),采用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染PML/RARα和DAPK1至293T細(xì)胞,通過(guò)Western blot檢測(cè),結(jié)果顯示DAPK1的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)PML/RARα蛋白的降解以及增強(qiáng)細(xì)胞自噬;在加入自噬抑制劑3-MA后,細(xì)胞自噬水平下降,同時(shí)DAPK1介導(dǎo)的PML/RARα蛋白降解作用明顯減弱,提示DAPK1可以促進(jìn)PML/RARα蛋白的降解,很可能與其介導(dǎo)的細(xì)胞自噬有關(guān)。結(jié)論:通過(guò)本課題的研究,首先,我們發(fā)現(xiàn)CSN在APL患者及NB4細(xì)胞株中呈高表達(dá);而在ATRA作用后CSN的表達(dá)水平明顯下調(diào)。其次,ATRA通過(guò)調(diào)節(jié)CSN-CRLs信號(hào)通路導(dǎo)致其下游靶蛋白DEPTOR、DAPK1等表達(dá)增加,而DAPK1可以促進(jìn)PML/RARα融合蛋白的自噬降解。本研究較系統(tǒng)地探討了CSN在ATRA誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化中的作用及其相關(guān)機(jī)制,為進(jìn)一步完善與發(fā)現(xiàn)新的誘導(dǎo)治療方案提供了實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：CSN復(fù)合物 急性早幼粒細(xì)胞白血病 CRLs-E3泛素連接酶 自噬
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R733.71
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文縮略詞對(duì)照10-11
• 第1章 前言11-16
• 第2章 材料與方法16-25
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料16-19
• 2.1.1 病例對(duì)象16
• 2.1.2 質(zhì)粒與細(xì)胞株16
• 2.1.3 藥物與主要試劑16-18
• 2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)器材來(lái)源18-19
• 2.1.5 抗體19
• 2.2 常用溶液的配制19-21
• 2.2.1 電泳緩沖液19
• 2.2.2 PBS緩沖液19
• 2.2.3 SDS蛋白上樣緩沖液19-20
• 2.2.4 10%過(guò)硫酸銨（APS）20
• 2.2.5 Tris-甘氨酸電泳緩沖液20
• 2.2.6 轉(zhuǎn)膜緩沖液20
• 2.2.7 考馬斯亮藍(lán)染液20
• 2.2.8 洗脫液20
• 2.2.9 麗春紅染色液20-21
• 2.2.10 DEPC水21
• 2.2.11 氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素（Kana）21
• 2.2.12 LB培養(yǎng)基21
• 2.2.13 100mM Cacl2配制21
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法21-25
• 2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)21-22
• 2.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)22
• 2.3.3 免疫印跡22
• 2.3.4 RT-PCR22-23
• 2.3.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染23-24
• 2.3.6 免疫熒光24
• 2.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理24-25
• 第3章 結(jié)果25-32
• 3.1 CSN復(fù)合物在全反式維甲酸誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)25-28
• 3.1.1 CSN在ATRA誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞中的表達(dá)25-27
• 3.1.2 CSN復(fù)合物亞基在APL患者及其治療過(guò)程中的表達(dá)27-28
• 3.2 全反式維甲酸誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞分化過(guò)程中CSN-CRLs信號(hào)通路的變化28-29
• 3.3 CSN-CRLs信號(hào)通路在全反式維甲酸誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞分化過(guò)程中的作用機(jī)制29-32
• 3.3.1 ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞自噬30
• 3.3.2 DAPK1參與調(diào)節(jié)的PML/RARα的自噬途徑降解30-32
• 第4章 討論32-35
• 第5章 結(jié)論35-36
• 致謝36-37
• 參考文獻(xiàn)37-40
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果40-41
• 綜述41-45
• 參考文獻(xiàn)45

【相似文獻(xiàn)】

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2 鄭培p

本文編號(hào)：699156