發(fā)布時間：2017-08-13 04:19

  本文關(guān)鍵詞：長鏈非編碼RNA-RMRP影響胃癌發(fā)生的機制及其臨床診斷價值研究

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【摘要】：目的胃癌(gastric cancer,GC)是世界第4大常見惡性腫瘤,居全球癌癥相關(guān)死因第2位,其5年總體生存率約25%。由于缺乏理想的早期胃癌診斷標(biāo)志物,80%患者被診斷時已處于疾病進展期,多數(shù)胃癌患者的預(yù)后受到了極大限制。同時,由于胃癌病理生理機制的不清又進一步影響其臨床治療效果。因此,揭示胃癌的分子特征、更好地理解胃癌發(fā)病機制是當(dāng)前胃癌研究的重點所在。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸(nuclotide,nt),具備多種生物學(xué)功能,涉及生理到病生一系列過程的非編碼RNA分子。它們可在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后等多個水平廣泛參與基因表達的調(diào)控,影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后密切相關(guān)。然而,lncRNA與胃癌的關(guān)系目前仍所知甚少。所以發(fā)現(xiàn)并鑒定胃癌相關(guān)lncRNA分子對于胃癌診治將有重要意義。因此,本研究的首要目的是探索lncRNA參與胃癌發(fā)生的分子機制,同時明確lncRNA作為腫瘤標(biāo)志物用于胃癌篩查和患者預(yù)后評估的臨床價值。方法1.在lncRNA芯片篩選胃癌組織和配對癌旁組織中差異表達lncRNA的基礎(chǔ)上,采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測lncRNA線粒體RNA處理核糖核酸內(nèi)切酶RNA組份(RNA component of mitochondrial RNA processing endoribonuclease,RMRP)在胃癌組織及其配對癌旁組織、正常胃黏膜上皮細胞株(GES-1)和5株胃癌細胞株(AGS,BGC-823,HGC-27,MGC-803和SGC-7901)中的表達水平差異。2.qrt-pcr分析rmrp在健康人胃黏膜組織、良性病變胃黏膜(潰瘍和胃炎)、異型增生胃黏膜和各期胃癌組織中的表達規(guī)律。3.克隆測序技術(shù)證明血漿、胃液rmrp和gapdhmrna的存在性,反復(fù)凍融試驗和不同時間和溫度放置試驗確定體液rmrp的穩(wěn)定性,細胞上清試驗探究體液rmrp來源。4.建立血漿和胃液lncrna檢測方法,分析血漿和胃液rmrp在胃癌發(fā)生各階段的變化規(guī)律;分析胃癌組織、血漿和胃液rmrp水平與患者臨床病理因素之間的關(guān)系;構(gòu)建受試者工作特征(receiveroperatingcharacteristic,roc)曲線,確定血漿、胃液rmrp診斷價值。5.mircode軟件預(yù)測與rmrp相互作用的mirna分子。6.設(shè)計并合成針對rmrp的小干擾rna(smallinterferingrna,sirna)和rmrp的pcdna3.1表達載體,轉(zhuǎn)染正常胃黏膜上皮細胞株和胃癌細胞株,qrt-pcr檢測rmrp和細胞周期蛋白d2(cyclind2)的水平變化;沉默或上調(diào)細胞rmrp表達水平后,分別采用流式細胞儀(flowcytometer)、實時細胞分析儀(real-timecellanalyzer,rtca)和平板克隆形成試驗(platecolonyformationassay)檢測細胞周期、凋亡和增殖的變化。7.建立裸鼠胃癌移植瘤模型,體內(nèi)實驗驗證rmrp的生物功能,分析血漿rmrp水平變化規(guī)律。結(jié)果1.與癌旁組織相比,rmrp在68.2%(90/132)胃癌組織中表達水平顯著降低;相對于正常胃黏膜上皮細胞株(ges-1),5株胃癌細胞株(ags,bgc-823,hgc-27,mgc-803和sgc-7901)中的rmrp表達水平顯著改變。2.qrt-pcr結(jié)果顯示,rmrp表達水平只在胃癌前病變組織(異型增生)和胃癌組織中顯著降低,在胃良性病變(胃潰瘍和胃炎)組織中沒有明顯改變,顯示出良好的胃癌相關(guān)性。3.克隆測序技術(shù)證明血漿、胃液中存在rmrp。血漿和胃液gapdhmrna水平恒定,是采用qrt-pcr方法檢測體液lncrna水平的理想?yún)⒄铡?.凍融試驗和不同時間、溫度放置試驗結(jié)果顯示血漿和胃液rmrp水平基本不變,體液rmrp的穩(wěn)定性可滿足臨床常規(guī)分析要求。細胞上清試驗顯示體液rmrp來源于細胞主動分泌。5.相對健康人群,血漿RMRP水平在胃癌患者群體中顯著升高,胃癌術(shù)后隨著腫瘤組織的切除明顯回落;胃癌患者組的胃液RMRP水平顯著升高。血漿和胃液RMRP作為胃癌篩查標(biāo)志物具有較高的敏感性和特異性,優(yōu)于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物。聯(lián)合檢測胃液RMRP、胃液CEA和血清CEA更可提高胃癌檢出率。6.胃癌組織RMRP的表達水平與Borrmann分型(P=0.002)、侵襲程度(P=0.037)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.014)、周圍神經(jīng)侵襲(P=0.008)以及組織CEA(P0.001)和CA19-9(P=0.003)表達情況密切相關(guān)。胃癌患者術(shù)前血漿RMRP水平與胃癌直徑大小(P=0.031)、胃癌分期(P=0.038)、侵襲程度(P=0.017)和組織CEA表達情況(P=0.032)正相關(guān),而術(shù)后2 w血漿RMRP回落程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.040)和組織CEA表達情況(P=0.049)密切相關(guān)。7.細胞實驗和動物實驗證明沉默RMRP表達能顯著抑制腫瘤增殖,而上調(diào)RMRP表達則能促進細胞增殖和腫瘤生長。8.沉默細胞RMRP表達能使細胞周期顯著阻滯于G0/G1期;相反,上調(diào)細胞RMRP表達水平后,能促進細胞周期從G0/G1期過渡到S期。進一步研究發(fā)現(xiàn),RMRP可充當(dāng)miR-206海綿,通過調(diào)控下游靶基因Cyclin D2表達發(fā)揮其細胞周期調(diào)控效應(yīng)。結(jié)論經(jīng)體內(nèi)和體外機制研究,從正反兩方面證明RMRP在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。大樣本臨床標(biāo)本分析顯示,RMRP是胃癌篩查和患者預(yù)后評估的潛在標(biāo)志物。
【關(guān)鍵詞】：胃癌 長鏈非編碼RNA RMRP 腫瘤標(biāo)志物 分子機制
【學(xué)位授予單位】：寧波大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-16
• 引言16-19
• 1 研究內(nèi)容和技術(shù)路線19-22
• 1.1 研究內(nèi)容19-21
• 1.1.1 建立多種樣本lnc RNA提取與定量分析方法19
• 1.1.2 組織RMRP表達水平檢測19
• 1.1.3 血漿RMRP水平檢測19
• 1.1.4 胃液RMRP水平檢測19-20
• 1.1.5 系統(tǒng)分析體液中RMRP來源，明確體液RMRP生物學(xué)特性20
• 1.1.6 細胞轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)染效率20
• 1.1.7 沉默和上調(diào)RMRP水平對胃癌細胞生長的影響20
• 1.1.8 建立裸鼠移植瘤動物模型，體內(nèi)驗證RMRP對胃癌細胞生長的影響20
• 1.1.9 分析RMRP影響細胞周期的分子機制20
• 1.1.10 其它lnc RNA與胃癌關(guān)系的研究20-21
• 1.2 技術(shù)路線21-22
• 2 材料與方法22-35
• 2.1 材料22-24
• 2.1.1 主要儀器22-23
• 2.1.2 主要試劑23-24
• 2.1.3 實驗標(biāo)本24
• 2.1.4 細胞株24
• 2.1.5 實驗動物24
• 2.1.6 倫理批準(zhǔn)及受試者知情權(quán)24
• 2.2 方法24-35
• 2.2.1 樣本的采集與保存24-25
• 2.2.2 樣本總RNA提取25-26
• 2.2.3 總RNA的定量與完整性檢測26
• 2.2.4 q RT-PCR檢測26-29
• 2.2.5 細胞培養(yǎng)29-30
• 2.2.6 pc DNA3.1-RMRP表達質(zhì)粒的構(gòu)建與擴增30-32
• 2.2.7 RMRP靶向si RNA設(shè)計與化學(xué)合成32
• 2.2.8 RTCA檢測細胞增殖32
• 2.2.9 流式細胞術(shù)32-33
• 2.2.10 細胞平板克隆形成試驗33
• 2.2.11 動物實驗33-34
• 2.2.12 血漿RMRP來源與穩(wěn)定性實驗34
• 2.2.13 統(tǒng)計分析34-35
• 3 實驗結(jié)果35-74
• 3.1 多種樣本RNA提取與定量分析方法的建立35-39
• 3.1.1 利用Trizol提取組織總RNA，改良Trizol LS法提取血漿、胃液總RNA35-36
• 3.1.2 非變性 1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性36
• 3.1.3 實時熒光q RT-PCR測定樣本RMRP36-37
• 3.1.4 q RT-PCR產(chǎn)物進行克隆后測序證實樣本RMRP存在性37
• 3.1.5 確認血漿和胃液GAPDH水平恒定，是RT-PCR檢測lnc RNA的理想?yún)⒄瘴?/span>37-39
• 3.2 q RT-PCR技術(shù)檢測組織RMRP表達水平39-44
• 3.2.1 分析胃癌組織和配對癌旁組織RMRP表達水平的差異39-40
• 3.2.2 分析胃癌組織RMRP表達水平與患者臨床病理因素之間的潛在關(guān)系40-42
• 3.2.3 分析胃黏膜異型增生組織和配對正常組織RMRP表達水平的差異42-43
• 3.2.4 橫向比較正常胃黏膜組織、良性病變（胃潰瘍、胃炎）、癌前病變（異型增生）、胃癌組織中RMRP表達情況43-44
• 3.3 q RT-PCR技術(shù)檢測血漿RMRP水平44-50
• 3.3.1 分析胃癌患者術(shù)前、術(shù)后2周血漿RMRP水平差異44
• 3.3.2 分析胃癌患者術(shù)前血漿RMRP水平與臨床病理因素之間的潛在關(guān)系44-46
• 3.3.3 分析胃癌患者術(shù)后血漿RMRP變化程度與臨床病理因素之間的潛在關(guān)系46-48
• 3.3.4 橫向比較健康人、胃癌術(shù)前患者、胃癌術(shù)后2周患者血漿RMRP水平48
• 3.3.5 構(gòu)建ROC曲線確定血漿RMRP作為胃癌篩查標(biāo)志物的靈敏度與特異度48-50
• 3.4 q RT-PCR技術(shù)檢測胃液RMRP水平50-54
• 3.4.1 分析正�；蜉p度胃炎、胃潰瘍、慢性萎縮性胃炎和胃癌患者胃液RMRP水平差異50
• 3.4.2 分析胃癌患者胃液RMRP水平與臨床病理因素之間的潛在關(guān)系50-52
• 3.4.3 構(gòu)建ROC曲線確定胃液RMRP作為胃癌篩查標(biāo)志物的靈敏度與特異度52-53
• 3.4.4 比較胃液RMRP、CEA和血清CEA在早期胃癌和進展期胃癌中的陽性檢出率53-54
• 3.5 系統(tǒng)分析體液RMRP來源，明確體液RMRP生物學(xué)特性54-56
• 3.5.1 細胞上清試驗初步探究RMRP的來源54-55
• 3.5.2 血漿反復(fù)凍融試驗探究體液RMRP穩(wěn)定性55
• 3.5.3 血漿不同放置時間和溫度試驗探究體液RMRP穩(wěn)定性55-56
• 3.5.4 構(gòu)建裸鼠胃癌移植瘤動物模型，驗證血漿RMRP水平變化56
• 3.6 細胞轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)染效率56-61
• 3.6.1 構(gòu)建pc DNA3.1-RMRP表達質(zhì)粒，合成RMRP靶向si RNA56-57
• 3.6.2 梯度轉(zhuǎn)染，確認pc DNA3.1-RMRP表達質(zhì)粒和靶向si RNA最佳轉(zhuǎn)染濃度57-58
• 3.6.3 驗證pc DNA3.1-RMRP表達質(zhì)粒和靶向si RNA轉(zhuǎn)染效率58-61
• 3.7 沉默和上調(diào)RMRP表達對胃癌細胞生長的影響61-69
• 3.7.1 沉默和上調(diào)胃癌細胞RMRP表達后，實時細胞分析儀檢測細胞增殖變化61-63
• 3.7.2 沉默和上調(diào)胃癌細胞RMRP表達后，，流式細胞儀檢測細胞凋亡的變化63-66
• 3.7.3 沉默和上調(diào)胃癌細胞RMRP表達后，流式細胞儀檢測細胞周期的變化66-68
• 3.7.4 細胞平板克隆形成試驗（plate colony formation assay）68-69
• 3.8 建立裸鼠移植瘤動物模型，體內(nèi)驗證RMRP對胃癌細胞生長的影響69-70
• 3.8.1 沉默和上調(diào)胃癌細胞MGC-803的RMRP表達后，分析其對裸鼠腫瘤生長的影響69-70
• 3.8.2 分析裸鼠接種腫瘤后，血漿RMRP水平的變化70
• 3.9 分析RMRP影響細胞周期的分子機制70-73
• 3.9.1 mi Rcode軟件預(yù)測RMRP下游mi RNA靶標(biāo)70-71
• 3.9.2 構(gòu)建RMRP - mi R206 Cyclin D2調(diào)控網(wǎng)絡(luò)71
• 3.9.3 沉默和上調(diào)RMRP后，檢測Cyclin D2表達水平變化71-73
• 3.10 其它長鏈非編碼RNA AA174084、HMlinc RNA717與胃癌關(guān)系的研究73-74
• 討論74-79
• 全文小結(jié)79-80
• 參考文獻80-84
• 附錄A 縮略詞84-86
• 附錄B 綜述86-103
• 參考文獻97-103
• 附錄C103-104
• 在學(xué)研究成果104-106
• 致謝106

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