本文關(guān)鍵詞：腎癌細胞中內(nèi)源性Wnt以自分泌的方式刺激Fzd7的胞吞作用

  更多相關(guān)文章： Fzd7 Wnt β-catenin 腎細胞癌細胞(RCC) 胞吞作用

【摘要】：Wnt蛋白作為分泌型糖蛋白可以結(jié)合Fzd受體家族的胞外N-末端半胱氨酸富含區(qū)域。在Wnt協(xié)同受體存在的條件下,Fzd受體可以應(yīng)答Wnt蛋白,從而激活經(jīng)典及非經(jīng)典信號通路。研究發(fā)現(xiàn),在多種腫瘤中Wnt和Fzd的過表達或者是組成性激活突變基因Fzd的表達與Wnt/β-catenin通路的激活相關(guān)。Wnt信號通路參與腎細胞癌(RCC)的形成與發(fā)展。Fzd7分子是Fzd受體家族的一員,參與調(diào)控細胞的增殖、分化、遷移、組織的極性以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等,但對Fzd7在腎透明細胞癌(cc RCC)中的表達研究目前并沒有相關(guān)報道。此外,現(xiàn)有研究結(jié)果表明,在多種腫瘤細胞中,Wnt可以以自分泌機制激活經(jīng)典以及非經(jīng)典信號通路,并且Wnt可通過結(jié)合膜表面Fzd受體來傳導(dǎo)信號通路并被內(nèi)化。一些研究者發(fā)現(xiàn)內(nèi)化的Wnt-受體復(fù)合體可增強Wnt信號通路。另有研究顯示,在經(jīng)典和非經(jīng)典信號通路中,Wnt配體都可以誘導(dǎo)相應(yīng)的Fzd受體發(fā)生胞吞,且Fzd胞吞或胞內(nèi)運輸所引起的變化對信號通路有一定的影響,這一作用似乎成為經(jīng)典及非經(jīng)典信號通路的必要組成成分。但是,對于腎細胞癌中,Wnt信號對Fzd受體的作用及相應(yīng)機制目前尚未有相關(guān)研究。本研究旨在檢測cc RCC組織及RCC細胞中Fzd7的表達水平,并以腎癌細胞為研究對象,通過控制Wnt信號的活性,探討其對Fzd7表達調(diào)節(jié)的相關(guān)機制。本論文主要包括以下兩部分內(nèi)容:一、cc RCC組織、癌旁組織及腎癌細胞中Fzd7的表達水平的檢測【目的】檢測cc RCC組織、癌旁組織及腎癌細胞中Fzd7的表達水平�！痉椒ā棵庖呓M化檢測53例cc RCC組織及相應(yīng)的癌旁組織中Fzd7的表達,western blot檢測三株RCC細胞系786-O、OS-RC-2、Caki-1細胞中Fzd7的表達,并通過內(nèi)切糖苷酶H和N-糖苷酶F進行去糖基化實驗,檢測RCC細胞中是否存在糖基化修飾現(xiàn)象�！窘Y(jié)果】免疫組化結(jié)果顯示,約36%的cc RCC組織存在Fzd7的表達,與癌旁組織相比,Fzd7在癌組織中過表達,說明Fzd7在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮作用;western blot結(jié)果顯示,三株RCC細胞中,Fzd7存在多條主條帶,包括Fzd7單體64 k D,以及60 k D,35 k D兩條條帶,內(nèi)切糖苷酶H和N-糖苷酶F處理對Fzd7在三種RCC細胞中的條帶分布無顯著影響,說明這三條條帶并非Fzd7未成熟的糖基化形式,那么分子量小于64k D的條帶很有可能是未完成合成的Fzd7或者是Fzd7胞吞后被降解的條帶。【結(jié)論】確定了cc RCC組織及RCC細胞中存在Fzd7的表達,為進一步研究RCC細胞中Wnt誘導(dǎo)Fzd7的胞吞作用提供了研究基礎(chǔ)。二、內(nèi)源性Wnt誘導(dǎo)Fzd7的胞吞作用的研究【目的】研究RCC細胞中內(nèi)源性Wnt信號分子誘導(dǎo)Fzd7受體的胞吞作用�！痉椒ā矿w外培養(yǎng)RCC細胞系786-O、OS-RC-2、Caki-1細胞,采用RT-PCR和Real-time PCR檢測幾種經(jīng)典Wnts的表達;用Wnt分泌抑制劑IWP-2、Clathrin抑制劑氯丙嗪和caveolae抑制劑制霉菌素處理細胞后,western blot檢測Fzd7蛋白的變化,以及IWP-2處理后細胞總蛋白中β-catenin和磷酸化β-catenin、細胞漿中β-catenin以及細胞核中β-catenin的變化;Real-time PCR檢測RCC細胞中Fzd7的表達水平,通過Fzd7sh RNA、GFPsh RNA轉(zhuǎn)染786-O細胞,并通過Wnt3a處理Fzd7sh RNA/786-O和GFPsh RNA/786-O細胞,MTS分別檢測細胞的增殖率�！窘Y(jié)果】Western blot結(jié)果顯示,Wnt分泌抑制劑IWP-2作用于RCC細胞后,可顯著增加Fzd7單體64k D條帶;Clathrin抑制劑氯丙嗪作用786-O細胞后,Fzd7單體以劑量依賴性的方式增加,而caveolae抑制劑制霉菌素則對Fzd7表達無明顯影響,說明內(nèi)源性Wnt主要通過clathrin介導(dǎo)刺激Fzd7的胞吞作用。不同濃度的IWP-2處理RCC細胞,10u M IWP-2處理后,可顯著增加磷酸化β-catenin水平,并降低總β-catenin水平,此外,IWP-2可抑制OS-RC-2細胞中β-catenin的核轉(zhuǎn)移,說明IWP-2可一定程度上抑制經(jīng)典通路的激活,且可推斷RCC細胞中內(nèi)源性Wnt激活經(jīng)典通路。Real-time PCR結(jié)果顯示,786-O細胞中Fzd7 m RNA水平顯著高于OS-RC-2以及Caki-1細胞;細胞增殖實驗顯示,與GFPsh RNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相比,Fzd7 sh RNA轉(zhuǎn)染可顯著降低786-O細胞的生長速度;Wnt3a處理Fzd7sh RNA/786-O細胞和GFPsh RNA/786-O細胞,可誘導(dǎo)細胞增殖,且Fzd7sh RNA/786-O細胞增殖速度高于GFPsh RNA/786-O細胞,說明Fzd7在腎細胞癌細胞的增殖過程中發(fā)揮作用�！窘Y(jié)論】RCC細胞中,內(nèi)源性Wnt激活經(jīng)典信號通路,誘導(dǎo)Fzd7的胞吞作用,并且這一作用由Clathrin途徑參與介導(dǎo),此外,Fzd7在腎細胞癌細胞的增殖過程中發(fā)揮作用。
【關(guān)鍵詞】：Fzd7 Wnt β-catenin 腎細胞癌細胞(RCC) 胞吞作用
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.11
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 引言12-15
• 第一部分 CCRCC組織、癌旁組織及腎細胞癌細胞中FZD7 的表達水平的檢測15-24
• 1 材料15-17
• 1.1 主要試劑15-16
• 1.2 主要溶液的配制16
• 1.3 實驗儀器16-17
• 1.4 實驗組織與細胞17
• 2 實驗方法17-19
• 2.1 細胞培養(yǎng)17
• 2.2 免疫組化檢測人ccRCC組織和癌旁組織中Fzd7 的表達水平17-18
• 2.3 RCC細胞中Fzd7 蛋白水平的檢測18
• 2.4 檢測腎癌細胞中Fzd7 是否存在糖基化修飾18-19
• 2.5 統(tǒng)計學(xué)分析19
• 3 實驗結(jié)果19-22
• 3.1 免疫組化檢測腎癌組織中Fzd7 表達水平19-21
• 3.2 Western blot檢測腎細胞癌細胞中Fdz7 的表達21-22
• 4 討論22-24
• 第二部分 內(nèi)源性WNT對FZD7 胞吞作用的調(diào)節(jié)機制研究24-37
• 1 材料24-26
• 1.1 主要試劑24-25
• 1.2 主要溶液的配置25
• 1.3 實驗儀器25-26
• 1.4 引物與質(zhì)粒26
• 2 實驗方法26-32
• 2.1 細胞培養(yǎng)26-27
• 2.2 反轉(zhuǎn)錄PCR、real-time PCR檢測腎細胞癌細胞中Fzd7、Wnt分子的mRNA水平27-28
• 2.3 Wnt/β-catenin信號通路與Fzd7 相關(guān)性的確定28-30
• 2.4 Western blot檢測氯丙嗪、制霉菌素對Fzd7 表達的影響30
• 2.5 Fzd7shRNA、GFPshRNA轉(zhuǎn)染 786-O細胞的構(gòu)建30-31
• 2.6 MTS法檢測細胞增殖31-32
• 2.7 統(tǒng)計學(xué)分析32
• 3 實驗結(jié)果32-35
• 3.1 在腎細胞癌細胞中內(nèi)源性Wnt刺激Fzd7 的胞吞作用32-33
• 3.2 內(nèi)源性Wnt通過clathrin介導(dǎo)刺激Fzd7 的胞吞作用33
• 3.3 內(nèi)源性Wnts激活經(jīng)典信號通路33-34
• 3.4 Fzd7 shRNA轉(zhuǎn)染可抑制腎細胞癌細胞的增殖34-35
• 4 討論35-37
• 論文總結(jié)37-38
• 參考文獻38-42
• 綜述 FZD7 作為腫瘤潛在治療靶點的研究42-51
• 參考文獻48-51
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文51-52
• 中英文縮略詞52-53
• 致謝53-54

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