發(fā)布時間：2017-08-04 12:23

  本文關(guān)鍵詞：miR-26a靶向GSK-3β調(diào)控β-catenin信號通路增強(qiáng)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： miR-26a GSK-?? 肺癌 侵襲轉(zhuǎn)移 ?-catenin

【摘要】：肺癌,尤其是非小細(xì)胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)在世界范圍內(nèi)是造成腫瘤相關(guān)性死亡最常見的原因,據(jù)WHO統(tǒng)計2013年約占男性腫瘤死亡的28%,女性的26%。肺癌發(fā)病患者當(dāng)中,非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌患者總數(shù)的75%-80%,主要包括三種病理組織學(xué)類型,分別為肺腺癌(Adenocarcinoma,CA)、肺鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)和大細(xì)胞癌(large-cell carcinoma,LCC)。據(jù)2008年全球腫瘤統(tǒng)計,肺癌是臨床診斷最常見的癌癥,在男性癌癥相關(guān)死亡原因中居首位。在女性中,肺癌是第四個最常見的診斷癌癥和第二大腫瘤相關(guān)死亡原因。在所有這些肺癌患者中處于疾病進(jìn)展期或已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的病例高達(dá)65%以上。侵襲轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為腫瘤治療失敗的重要原因,是腫瘤治療亟需解決的關(guān)鍵難題之一。microRNAs(miRNAs)是一類長度大約由19-25個核苷酸構(gòu)成的非編碼小分子RNA,目前研究發(fā)現(xiàn)它可以通過多種生物學(xué)機(jī)制調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá),但microRNAs發(fā)揮作用的具體機(jī)制目前仍不十分清楚。microRNA最初被作為基因附屬物被發(fā)現(xiàn),最終認(rèn)為它是基因組的重要組成部分被命名為微小RNA基因組,它們被認(rèn)為是人類基因組中未被探明的黑暗神秘物質(zhì)。作為新的非編碼RNA庫中的成員,microRNAs通過與靶基因mRNA的3’-UTR(Untranslated Region)域結(jié)合,從而使靶基因降解或者抑制轉(zhuǎn)錄后翻譯來影響靶蛋白的表達(dá)。microRNAs異常表達(dá)已經(jīng)在很多腫瘤中被發(fā)現(xiàn),包括在肺癌組織等。近年來許多研究表明,microRNAs與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。一些功能性研究發(fā)現(xiàn)miR-26a在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要作用,并取得了一定的研究進(jìn)展。在本實驗研究中,我們進(jìn)一步探討了miR-26a靶向調(diào)控GSK-3?通過?-catenin信號通路對肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響。前期研究中我們應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)miR-26a在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平較正常支氣管上皮細(xì)胞系降低,在肺原位癌組織和肺淋巴轉(zhuǎn)移癌組織中較正常肺組織表達(dá)降低,但肺淋巴轉(zhuǎn)移癌組織較原位肺癌組織表達(dá)增高。進(jìn)而應(yīng)用劃痕和Transwell小室實驗檢測了miRNA-26a靶向PTEN通過AKT通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲遷移。應(yīng)用細(xì)胞活力計數(shù)分析實驗檢測了miR-26a對肺癌細(xì)胞增殖活力無影響。因為mi RNA功能涉及多個基因多條通路的復(fù)雜性,為了進(jìn)一步了解mi R-26a對肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的功能,本實驗中我們采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測了miR-26a潛在的靶基因GSK-3?,進(jìn)而應(yīng)用熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C了mi R-26a靶向于GSK-3?基因的3’-UTR區(qū),Western-blot法檢測miR-26a靶向抑制GSK-3?的蛋白表達(dá)。最后應(yīng)用蛋白印跡Western-blot法檢測了GSK-3?下游靶蛋白?-catenin的表達(dá)變化,檢測了miR-26a作用于GSK-3?進(jìn)而對?-catenin發(fā)生核內(nèi)轉(zhuǎn)位和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因C-myc/Cyclin D1表達(dá)變化的影響。綜合我們的數(shù)據(jù)顯示mi R-26a在肺癌組織中較癌旁正常組織中表達(dá)下調(diào)(***P0.001),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。miR-26a在肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)水平高于原發(fā)肺癌組織(**p0.01),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。通過對細(xì)胞增殖活力分析實驗研究表明轉(zhuǎn)染100nM和200nM mi R-26a模擬物對肺癌細(xì)胞增殖沒有影響。侵襲轉(zhuǎn)移功能性實驗劃痕和小室實驗研究證實:通過瞬時轉(zhuǎn)染法將miR-26a模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞,結(jié)果顯示miR-26a的表達(dá)水平能夠顯著影響癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,過表達(dá)miR-26a促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移,抑制miR-26a的表達(dá)降低肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。物信息學(xué)軟件初步預(yù)測GSK-3?是miR-26a的直接作用靶點(diǎn),進(jìn)一步熒光素酶報告基因?qū)嶒灱癢estern-blot法證實GSK-3?是mi R-26a的直接靶點(diǎn)。分子機(jī)制研究揭示miR-26a增強(qiáng)GSK-3?的磷酸化水平,降低GSK-3?總蛋白的表達(dá)水平,進(jìn)而上調(diào)?-catenin的表達(dá),并促進(jìn)?-catenin蛋白向肺癌細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,從而激活WNT/?-catenin信號通路。我們還檢測了miR-26a對?-catenin信號通路的下游調(diào)控基因C-myc、Cyclin D1的表達(dá)變化。Western-blot法和Real-time PCR法的結(jié)果證實miR-26a促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因C-myc、Cyclin D1、?-catenin、MMP-2、VEGF、Twist等表達(dá)上調(diào)。本研究揭示了miR-26a促進(jìn)肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的新機(jī)制,即通過調(diào)控其靶基因GSK-3?,促進(jìn)?-catenin表達(dá)及核內(nèi)轉(zhuǎn)位,進(jìn)而激活Wnt/?-catenin信號通路,影響下游侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因C-myc、CyclinD1的表達(dá),功能性研究也更加清晰的表明miRNA-26a通過靶向GSK-3?增強(qiáng)肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移潛能。以上研究為miR-26a作為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ),后續(xù)研究將通過動物體內(nèi)模型對其作用及其機(jī)制進(jìn)行深入研究。
【關(guān)鍵詞】：miR-26a GSK-?? 肺癌 侵襲轉(zhuǎn)移 ?-catenin
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 縮略語/符號說明11-12
• 前言12-16
• 研究現(xiàn)狀及目的12-14
• 實驗設(shè)計路線圖14-15
• 研究內(nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題15-16
• 第一部分：實驗材料和實驗儀器16-23
• 1. 實驗材料16-20
• 2. 實驗儀器20-23
• 第二部分：課題組前期工作23-30
• 1. mi R-26a在肺癌組織及肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)23-24
• 2. mi R-26a對肺癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的功能性影響24-28
• 3. mi R-26a對侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的影響28-29
• 4.討論29-30
• 第三部分：mi R-26a靶點(diǎn)GSK-3b的預(yù)測及驗證30-51
• 1. miR-26a作用靶點(diǎn)GSK-3b的預(yù)測30-33
• 1.1 實驗方法30-33
• 1.2 實驗結(jié)果33
• 2. mi R-26a靶向GSK-3b熒光素酶報告基因?qū)嶒?/span>33-45
• 2.1 實驗方法33-44
• 2.2 實驗結(jié)果44-45
• 3. mi R-26a調(diào)控GSK-3b蛋白表達(dá)變化的研究45-50
• 3.1 實驗方法45-49
• 3.2 實驗結(jié)果49-50
• 4. 討論50-51
• 第四部分：mi R-26a靶向GSK-3b調(diào)控b-catenin信號通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移潛能的機(jī)制研究51-89
• 1. miR-26a靶向GSK-3b調(diào)控b-catenin蛋白表達(dá)52-58
• 1.1 實驗方法52-57
• 1.2 實驗結(jié)果57-58
• 2. mi R-26a調(diào)控b-catenin蛋白核轉(zhuǎn)位的研究58-60
• 2.1 實驗方法58-59
• 2.2 實驗結(jié)果59-60
• 3. mi R-26a調(diào)控b-catenin通路轉(zhuǎn)移相關(guān)基因C-myc/Cyclin D1的研究60-71
• 3.1 實驗方法60-69
• 3.2 實驗結(jié)果69-71
• 4. mi R-26a靶向GSK-3b促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移71-85
• 4.1 實驗方法71-81
• 4.2 實驗結(jié)果81-85
• 5. 討論85-89
• 參考文獻(xiàn)89-94
• 發(fā)表論文及參加科研情況說明94-95
• 綜述 microRNA調(diào)控腫瘤耐藥的研究進(jìn)展95-116
• 綜述參考文獻(xiàn)109-116
• 致謝116-117

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：619569