本文關(guān)鍵詞：癌基因Ras及其常見突變與p53協(xié)同作用對結(jié)腸癌細胞化療藥物敏感性的研究

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【摘要】：目的Ras是一種原癌基因,其突變廣泛存在于多種腫瘤細胞中,在結(jié)直腸癌中突變率可達30%以上,與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展以及靶向治療療效預(yù)測等均有密切關(guān)系。突變后的Ras結(jié)構(gòu)發(fā)生改變引起下游多條信號通路激活,并且與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。p53基因是發(fā)現(xiàn)最早的一種腫瘤抑制基因,參與細胞周期、凋亡、衰老、維持基因組穩(wěn)定性、修復(fù)損傷DNA。近年來,p53作為基因治療的靶標已初步應(yīng)用于臨床,通過對p53基因表達水平的提升以及p53正常功能的修復(fù)參與腫瘤的治療。研究發(fā)現(xiàn),在腫瘤發(fā)生過程中p53與Ras介導(dǎo)的通路之間存在著復(fù)雜的相互協(xié)同作用關(guān)系。因此,在Ras高水平突變的結(jié)直腸癌藥物治療過程中,p53與Ras基因的突變之間存在著怎樣的相互作用關(guān)系需要通過體內(nèi)、體外的科學實驗進行深入的研究。本課題旨在利用體外結(jié)腸癌細胞模型,探討p53與Ras及常見突變協(xié)同作用對結(jié)腸癌細胞奧沙利鉑藥物敏感性的影響。為在Ras高突變率的情況下,研究提高化療藥物療效以及開發(fā)新的輔助治療手段提供可靠的實驗依據(jù)。方法第一部分:收集67對結(jié)直腸癌患者癌組織和癌旁組織,提取m RNA,RT-PCR擴增K-Ras和p53序列,檢測K-Ras和p53突變情況;應(yīng)用卡方檢驗分析癌組織和癌旁組織突變的差異,應(yīng)用秩相關(guān)性分析K-Ras突變與p53突變的關(guān)系。第二部分:體外培養(yǎng)HCT116 p53-/-細胞系,分6組:(1)Ras單轉(zhuǎn)染組;(2)Ras V12單轉(zhuǎn)染組;(3)Ras N17單轉(zhuǎn)染組;(4)Ras+Ad-p53組;(5)Ras V12+Ad-p53組;(6)Ras N17+Ad-p53組;培養(yǎng)HCT116 p53-/-細胞系密度達60%后,經(jīng)過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及病毒感染24小時,奧沙利鉑處理12小時。利用Calcein/PI熒光原位分析不同處理對細胞凋亡水平的影響;應(yīng)用MTT法檢測奧沙利鉑作用下細胞存活率;提取細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后實時定量PCR分析凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2的m RNA轉(zhuǎn)錄水平;提取細胞總蛋白,通過WB法檢測奧沙利鉑作用下各組中Bax、Bcl-2、p53和Ras等基因相關(guān)蛋白表達情況。結(jié)果1.收集67對結(jié)直腸癌患者的癌組織和癌旁組織,提取m RNA,逆轉(zhuǎn)錄后擴增K-Ras和p53基因,測序檢測突變情況發(fā)現(xiàn):K-Ras第12個氨基酸突變率最高,在癌組織中達到25.37%(17/67),癌旁組織中突變顯著低于癌組織為14.9%(10/67)(p0.01);第13個氨基酸突變率也較高,癌組織和癌旁組織中分別為10.45%(7/67)和2.99%(2/67)(p0.01);第17個氨基酸突變率最低,僅有1個患者癌組織和癌旁組織發(fā)生第17位氨基酸的突變(p0.05);p53基因的236位點突變率在癌組織中為10.45%(7/67),癌旁組織中為5.97%(4/67)(p0.05);249位點突變率在癌組織中為20.9%(14/67),癌旁組織中為11.94%(8/67)(p0.05);應(yīng)用秩相關(guān)性分析K-Ras突變與p53突變之間無顯著相關(guān)性。2.通過Calcein-AM/PI染色我們發(fā)現(xiàn),當p53缺失時,Ras單轉(zhuǎn)染組、Ras V12單轉(zhuǎn)染組、Ras N17單轉(zhuǎn)染組的凋亡率分別為(8.3±1.5)%、(16.8±1.7)%、(4.4±1.6)%,其中Ras V12單轉(zhuǎn)染組凋亡率明顯高于其他兩組,這提示我們在L-OHP藥物作用下,Ras V12突變顯著提高了細胞凋亡率;當p53高表達時,Ras+Ad-p53、Ras V12+Ad-p53、Ras N17+Ad-p53凋亡率分別為(13.5±1.9)%、(25.9±2.2)%、(7.6±1.2)%,Ras V12+Ad-p53組凋亡率最高,而對比于p53缺失的三組,p53高表達的三組凋亡率明顯增高,這說明L-OHP藥物作用下Ras與p53具有協(xié)同增強細胞的凋亡的作用。3.為了證實Calcein-AM/PI染色結(jié)果,我們又應(yīng)用了MTT法檢測奧沙利鉑作用下各種細胞的存活數(shù)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Ras N17轉(zhuǎn)染組、Ras轉(zhuǎn)染組、Ras V12轉(zhuǎn)染組、Ras N17+p53組、Ras+p53組、Ras V12+p53組六組的平均OD值分別為0.875、0.769、0.647、0.482、0.316、0.247,細胞相對存活率分別為93.3%,82.0%,69.0%,51.4%,33.7%,26.3%。4.隨后我們通過免疫印記結(jié)果來進一步證實,Ras+Ad-p53、Ras V12+Ad-p53、Ras N17+Ad-p53三組的凋亡蛋白Bax表達水平均高于Ras單轉(zhuǎn)染組、Ras V12單轉(zhuǎn)染組、Ras N17單轉(zhuǎn)染組,驗證了Ras與p53具有協(xié)同增強細胞凋亡的作用,Bcl-2的表達水平則與Bax結(jié)果相反;而在Ras+Ad-p53、Ras V12+Ad-p53、Ras N17+Ad-p53三組中,Ras V12+Ad-p53組的Bax表達水平最高,Ras+Ad-p53組次之,Ras N17+Ad-p53最低,Bcl-2的表達水平則與Bax結(jié)果相反。5.最后,我們通過實時熒光定量PCR來表明,p53高表達與缺失條件下,Ras V12轉(zhuǎn)染組Bax m RNA表達水平均顯著高于Ras轉(zhuǎn)染組和Ras N17轉(zhuǎn)染組,且p53高表達時較p53缺失時表達水平明顯增高。結(jié)論1.在結(jié)直腸癌患者中,癌組織中K-Ras和p53基因突變率高于癌旁組織,進一步證實了這兩個基因的突變與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān);2.在化療藥物奧沙利鉑作用下,不同Ras突變體的過表達能夠引起細胞凋亡水平的改變;3.p53與Ras具有協(xié)同作用,過表達p53能夠提高Ras的促細胞凋亡作用,提高細胞對藥物的敏感性。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)直腸癌 K-Ras p53基因 凋亡
【學位授予單位】：濟南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.35
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 主要符號表11-13
• 第一章 前言13-21
• 第二章 材料與方法21-29
• 2.1 實驗試劑及器材21-24
• 2.2 實驗方法24-29
• 第三章 結(jié)果29-33
• 3.1 第一部分29
• 3.2 第二部分29-33
• 第四章 討論33-41
• 第五章 結(jié)論41-43
• 參考文獻43-51
• 附錄51-57
• 攻讀碩士期間參與發(fā)表文章及獲獎情況57-58
• 致謝58

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本文編號：575046