本文關(guān)鍵詞：Drosha沉默對(duì)胃癌細(xì)胞遷移影響及其分子機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： Drosha基因 胃癌 生物學(xué)功能 Drosha micro RNA 遷移 LAMC2 CD82

【摘要】：第一部分Drosha沉默對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響目的:探討胃癌細(xì)胞中沉默Drosha表達(dá)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響方法:設(shè)計(jì)靶向Drosha的干擾序列并重組到慢病毒載體,建立Drosha基因沉默的穩(wěn)定細(xì)胞株,通過Real-time PCR和Western blot驗(yàn)證Drosha在m RNA及蛋白水平上的干擾情況;分別采用甲基噻唑基四唑(MTT)方法、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞株的增殖、遷移、凋亡及對(duì)表阿霉素敏感性的變化。結(jié)果:成功構(gòu)建穩(wěn)定干擾Drosha表達(dá)的細(xì)胞株,且同陰性對(duì)照組相比,干擾Drosha表達(dá)后對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡無明顯影響;經(jīng)表阿霉素處理對(duì)照組及干擾組細(xì)胞24h后,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,干擾Drosha組細(xì)胞凋亡率(78.8±1.9)%明顯高于對(duì)照組(59.22±1.0)%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);經(jīng)表阿霉素處理后,在干擾Drosha組中凋亡相關(guān)的蛋白caspase3、caspase9、Bax表達(dá)明顯上調(diào),而抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低。劃痕實(shí)驗(yàn)、Tranwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)敲低Drosha表達(dá)后細(xì)胞遷移能力降低,結(jié)論:在胃癌細(xì)胞中沉默Drosha表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖周期及凋亡無明顯影響,但能降低癌細(xì)胞的遷移能力及提高細(xì)胞對(duì)表阿霉素的敏感性。第二部分Drosha對(duì)胃癌細(xì)胞遷移影響分子機(jī)制研究目的:探討沉默Drosha表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞遷移影響的具體分子機(jī)制方法:分別提取Drosha穩(wěn)定沉默及對(duì)照組細(xì)胞中總RNA,進(jìn)行micro RNA芯片檢測(cè)并篩選差異mi RNA。生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)差異mi RNA靶基因,通過DIVID軟件將靶基因進(jìn)行KEGG-pathway富集分析;結(jié)合文獻(xiàn)及信號(hào)通路分析選擇與細(xì)胞遷移相關(guān)的靶基因,并通過芯片數(shù)據(jù)及網(wǎng)站預(yù)測(cè)篩選出調(diào)控靶基因的差異mi RNA;采用熒光素酶報(bào)告基因及q RT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶基因受相應(yīng)差異mi RNA的調(diào)控;通過q RT-PCR和Western blot的方法檢測(cè)靶基因在穩(wěn)定沉默Drosha表達(dá)細(xì)胞中的情況;Kaplan生存曲線分析靶基因與胃癌預(yù)后的關(guān)系,運(yùn)用免疫組化方法及q RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靶基因在胃癌組織中的表達(dá),Western blot檢測(cè)靶基因在各細(xì)胞株中的表達(dá);分別在野生型及沉默Drosha表達(dá)的MGC-803細(xì)胞中干擾和過表達(dá)靶基因,通過Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證不同組MGC-803細(xì)胞中遷移能力的變化情況,Weatern blot檢測(cè)靶基因下游與遷移相關(guān)蛋白的活化情況。結(jié)果:Drosha敲低后引起61個(gè)micro RNAs表達(dá)發(fā)生變化(變化倍數(shù)大于2),其中47個(gè)下調(diào)和14個(gè)上調(diào);KEGG富集分析顯示靶基因參與ECM受體、p53、MAPK信號(hào)通路等的調(diào)控;結(jié)合文獻(xiàn)選擇與遷移相關(guān)的靶基因?yàn)長(zhǎng)AMC2和CD82,熒光素酶報(bào)告基因及q RT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)mi RNA-622和mi RNA-197分別靶向調(diào)控LAMC2和CD82;且在芯片數(shù)據(jù)中mi RNA-622表達(dá)上調(diào),mi RNA-197表達(dá)下調(diào);在敲低Drosha表達(dá)的MGC-803及NUGC-3細(xì)胞中,LAMC2 m RNA及蛋白表達(dá)水平下降,而CD82在m RNA及蛋白水平上表達(dá)增高;Kaplan生存曲線分析表明LAMC2高表達(dá)患者生存率低而CD82高表達(dá)患者生存率明顯高于對(duì)照組;與癌旁組織相比LAMC2在癌中高表達(dá)而CD82在癌組織低表達(dá);在Drosha沉默表達(dá)的MGC-803細(xì)胞中過表達(dá)LAMC2基因促進(jìn)了細(xì)胞遷移、而在野生型MGC-803細(xì)胞中過表達(dá)CD82則抑制胃癌細(xì)胞遷移能力;Western blot結(jié)果顯示差異表達(dá)的LAMC2和CD82能抑制下游EGFR-ERK1/2及MMP7信號(hào)通路的活化。結(jié)論:Drosha沉默引起mi RNA-622和mi RNA-197差異表達(dá),并分別通過靶向調(diào)控LAMC2和CD82抑制EGFR-ERK1/2及MMP7信號(hào)通路的活化,降低了胃癌細(xì)胞遷移能力。
【關(guān)鍵詞】：Drosha基因 胃癌 生物學(xué)功能 Drosha micro RNA 遷移 LAMC2 CD82
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.2
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對(duì)照4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 第一部分Drosha沉默對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響12-30
• 前言12-13
• 1 材料與方法13-22
• 2 結(jié)果22-27
• 3 討論27-28
• 參考文獻(xiàn)28-30
• 第二部分Drosha沉默對(duì)胃癌細(xì)胞遷移影響的分子機(jī)制研究30-39
• 前言30-31
• 1 材料與方法31
• 2 結(jié)果31-37
• 3 討論37-39
• 參考文獻(xiàn)39-41
• 全文總結(jié)41-42
• 文獻(xiàn)綜述42-49
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 致謝49-50
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文50

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本文編號(hào)：563594