本文關鍵詞：miR-145在肺癌細胞中調控UHRF1并逆轉DNA甲基化譜式的改變

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【摘要】：在中國,肺癌的預后較差,生存率較低,是最嚴重的癌癥之一。而DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾,被發(fā)現(xiàn)在包括肺癌在內的大多數(shù)癌癥中均是處于異常的狀態(tài),比如重復序列的低甲基化和抑癌基因啟動子區(qū)的高甲基化。在近年的研究中,腫瘤特異的DNA甲基化譜式異常被認為是DNMT1,DNMT3A, DNMT3B和UHRF1的異常高表達所導致的,而且在本研究的數(shù)據(jù)分析以及腫瘤細胞系和肺癌臨床樣本的檢測中,我們也確實驗證了UHRF1/DNMTs在腫瘤中的異常高表達。但現(xiàn)在對于UHRF1/DNMTs在腫瘤中異常高表達的原因還不是非常的清楚。作為一個重要的調控因子,microRNA可能參與了對UHRF1/DNMTs的調控。因此,我們希望能夠找到與UHRF1/DNMTs在大多數(shù)腫瘤中高表達相關的miRNAs。首先,通過miRNA靶基因預測數(shù)據(jù)庫,我們篩選出預測到的靶向UHRF1/DNMTs的miRNAs,進而通過分析從數(shù)據(jù)庫下載的這些miRNAs在腫瘤中的表達情況,我們篩選出在大多數(shù)腫瘤中均是低表達的miRNAs。隨后,結合初步的miRNA mimics轉染實驗和我們檢測的這些miRNAs在細胞系和臨床樣本中的表達情況,我們篩選到了一個腫瘤抑制因子miR-145來進行下一步的實驗。經過轉染實驗,我們發(fā)現(xiàn)miR-145能夠同時在蛋白水平和mRNA水平抑制UHRF1和DNMT1的表達,而且是通過直接靶向UHRF1的3'-UTR來抑制其表達的。此外,我們發(fā)現(xiàn)miR-145能夠通過將細胞限制在細胞周期的G1期來抑制細胞的增殖,而且過表達miR-145還能夠使A549細胞的整體DNA甲基化水平下降2.8%,同時也降低了除增強子外的大部分基因組元件的DNA甲基化水平。另外,一些抑癌基因(如CDH13, DLC1,RASSF1和CDH1)的啟動子區(qū)的DNA甲基化水平也會受miR-145的影響而分別有一定程度的下降。有趣的是,我們還發(fā)現(xiàn)重復序列LINE1和HERV-K的DNA甲基化水平在miR-145處理后的A549細胞中分別上升了7.9%和7.1%。這些都說明了miR-145能夠使腫瘤特異的DNA甲基化譜式得到一定程度的逆轉。同時,通過檢測細胞系和肺癌臨床樣本,我們還發(fā)現(xiàn)miR-145本身上游啟動子區(qū)miR-145-promoter及其與miR-143共有的啟動子區(qū)miR-143/145-promoter在腫瘤細胞中與在正常細胞中相比是處于高甲基化狀態(tài)的,而且兩者的DNA甲基化水平與miR-145的表達有明顯的負相關性,其中miR-143/145-promoter更為明顯。通過在A549中敲低UHRF1,我們發(fā)現(xiàn)UHRF1能夠通過影響這兩個miR-145啟動子區(qū)域的DNA甲基化來調控miR-145本身的表達,而且我們發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過表達miR-145的A549細胞中的內源miR-143/145-promoter的DNA甲基化水平明顯下降了16.3%,而miR-145-promoter基本沒有變化。綜上所述,本研究表明miR-145與UHRF1和DNA甲基化之間形成了調控環(huán)路,而且它們相互間的調控平衡的異�？赡軐е铝薝HRF1的高表達以及腫瘤的發(fā)生。
【關鍵詞】：肺癌 DNA甲基化 UHRF1 miR-145
【學位授予單位】：華東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 第一章 文獻綜述12-22
• 1 DNA甲基化與癌癥12-15
• 1.1 DNA甲基化12-13
• 1.2 DNA甲基化酶系統(tǒng)13
• 1.3 癌癥中DNA甲基化的變化13-15
• 1.4 癌癥中DNA甲基化酶系統(tǒng)的變化15
• 2 miRNA與DNA甲基化酶系統(tǒng)15-17
• 2.1 miRNA15-17
• 2.2 miRNA對DNA甲基化酶系統(tǒng)的調控17
• 3 miR-145的研究進展17-21
• 3.1 miR-145的定位和調控17-18
• 3.2 miR-145與干細胞分化18-19
• 3.3 miR-145與癌癥19-21
• 4 本研究的目的和意義21-22
• 第二章 實驗材料與方法22-47
• 1 實驗材料22-30
• 1.1 細胞株22
• 1.2 質粒22
• 1.3 抗體22
• 1.4 細菌22
• 1.5 組織樣本22-23
• 1.6 實驗試劑和試劑盒23-25
• 1.7 實驗儀器和耗材25-26
• 1.8 溶液配制26-27
• 1.9 引物序列27-30
• 2 實驗方法30-45
• 2.1 細胞培養(yǎng)30
• 2.2 細胞傳代30-31
• 2.3 細胞復蘇31
• 2.4 細胞凍存31-32
• 2.5 細胞轉染32-33
• 2.6 穩(wěn)定細胞系的構建33-34
• 2.7 質粒構建34-36
• 2.8 總RNA的抽提36
• 2.9 總DNA的抽提36
• 2.10 逆轉錄反應36-37
• 2.11 實時熒光定量PCR37
• 2.12 流式細胞儀分析細胞周期37-38
• 2.13 雙熒光素酶報告基因實驗38-39
• 2.14 蛋白免疫印跡(Western Blotting)39-41
• 2.15 細胞增殖實驗41-42
• 2.16 簡化的有代表性的亞硫酸氫鹽測序(RRBS)42-44
• 2.17 亞硫酸氫鹽擴增子測序(BSAS)44-45
• 3 數(shù)據(jù)分析45-47
• 3.1 實驗用到的數(shù)據(jù)庫45-46
• 3.2 實驗用到的軟件46
• 3.3 DNA甲基化水平的分析46-47
• 第三章 實驗結果47-65
• 1 DNMTs和UHRF1在腫瘤細胞系和肺癌組織中的高表達47-50
• 2 調控DNMTs/UHRF1的候選miRNA的篩選50-56
• 3 miR-145在腫瘤細胞中對UHRF1和DNMT1的抑制56-59
• 4 miR-145在腫瘤細胞中導致細胞周期停滯和DNA甲基化變化59-62
• 5 miR-145本身受啟動子區(qū)CpGi的DNA甲基化調控62-65
• 第四章 討論65-68
• 攻讀學位期間待發(fā)表論文68-69
• 參考文獻69-75
• 致謝75

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