本文關(guān)鍵詞：miR-543通過抑制SIRT1促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展

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【摘要】：研究背景：胃癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,是腫瘤死亡的第三大常見原因。雖然胃癌的發(fā)病率與死亡率一直是逐年降低的,但其仍然是世界范圍內(nèi)一個重要的公共衛(wèi)生問題。我們前期研究證實SIRT1在胃癌中的表達(dá)是下調(diào)的,它通過抑制細(xì)胞周期蛋白cyclinD1誘導(dǎo)G1期停滯,從而抑制胃癌的發(fā)生發(fā)展。然而,引起SIRT1下調(diào)潛在的上游調(diào)控機制仍然未知。研究目的：探究miR-543通過調(diào)控SIRT1的表達(dá)促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制,為胃癌的治療提供新的靶點。研究結(jié)果：1.我們利用三種不同的生物信息學(xué)軟件TargetScan、PicTar和miRanda,初步篩選出了8種可能靶向調(diào)控SIRT1的候選miRNAs,分別是miR-92a-3p、miR-128、 miR-132-3p、miR-135、miR-138、miR-181、miR-199a-5p和miR-543,其中miR-543與SIRT1 mRNA3'-UTR區(qū)有兩個不同的結(jié)合位點,在胃癌細(xì)胞系BGC-823中轉(zhuǎn)染候選miRNAs的mimics通過Western blotting實驗方法發(fā)現(xiàn)miR-543可以使BGC-823細(xì)胞中SIRT1的蛋白表達(dá)水平顯著降低,其他的幾個miRNA對SIRT1的表達(dá)均無明顯影響。2.在分子水平上,候選miRNA的mimics和inhibitor分別轉(zhuǎn)染人胃粘膜上皮永生細(xì)胞系GES-1和胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、BGC-823,通過qRT-PCR、Western blotting和雙熒光素酶活性實驗方法分別證實候選miRNA對SIRT1的表達(dá)調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在BGC-823和GES-1細(xì)胞中miR-543使SIRT1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào),而在AGS細(xì)胞中雖然miR-543使SIRT1的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化,但是SIRT1的蛋白表達(dá)水平也是明顯下調(diào)的。在BGC-823細(xì)胞中分別共同轉(zhuǎn)染miR-543 mimics/inhibitor和SIRT1mRNA3'-UTR野生型載體WT、SIRT1mRNA3'-UTR突變載體Mut-1(第一個位點發(fā)生突變)、SIRT1mRNA3'-UTR突變載體Mut-2(第二個位點發(fā)生突變)、SIRT1mRNA3'-UTR突變載體Mut-bo(兩個位點同時發(fā)生突變),結(jié)果發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染miR-543 mimics后,SIRT1 WT質(zhì)粒使細(xì)胞熒光素酶活性降低,SIRT1Mut-1質(zhì)粒、SIRT1 Mut-2質(zhì)粒使細(xì)胞的熒光素酶活性都有一定程度的恢復(fù),而SIRT1 Mut-bo質(zhì)粒使細(xì)胞的熒光素酶活性得到完全恢復(fù)。相反,轉(zhuǎn)染miR-543 inhibitor后,SIRT1 WT質(zhì)粒使細(xì)胞熒光素酶活性增加,SIRT1Mut-1質(zhì)粒、SIRT1 Mut-2質(zhì)粒使細(xì)胞的熒光素酶活性都有一定程度的恢復(fù),而SIRT1 Mut-bo質(zhì)粒使細(xì)胞的熒光素酶活性得到完全恢復(fù)。3.在細(xì)胞水平上,通過MTS實驗方法檢測候選miRNA對細(xì)胞增殖能力的影響。MTS實驗表明,在人胃粘膜上皮永生細(xì)胞系GES-1和胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、BGC-823中轉(zhuǎn)染miR-543的mimics后,AGS,BGC-823和GES-1細(xì)胞的增殖能力明顯增加。相反,轉(zhuǎn)入miR-543的inhibitor后,AGS、BGC-823和GES-1細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制。在BGC-823細(xì)胞中共同轉(zhuǎn)染miR-543mimics和SIRT1表達(dá)載體,SIRT1的表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-543促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力。4.在細(xì)胞水平上,通過克隆形成實驗檢測候選miRNA對細(xì)胞克隆形成能力的影響�？寺⌒纬蓪嶒灡砻�,在人胃粘膜上皮永生細(xì)胞系GES-1和胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、BGC-823中轉(zhuǎn)染miR-543的mimics后,AGS, BGC-823和GES-1細(xì)胞的克隆形成能力明顯增加。相反,轉(zhuǎn)入miR-543的inhibitor后,AGS、BGC-823和GES-1細(xì)胞的克隆形成能力受到顯著抑制。在BGC-823細(xì)胞中共同轉(zhuǎn)染miR-543 mimics和SIRT1表達(dá)載體,SIRT1的表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-543促進(jìn)細(xì)胞的克隆形成能力。5.在細(xì)胞水平上,用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測候選miRNA對細(xì)胞周期進(jìn)程的影響,并通過Western blotting檢測SIRT1下游分子細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在人胃癌細(xì)胞AGS和BGC-823中轉(zhuǎn)染miR-543的mimics后,細(xì)胞更多的進(jìn)入到了G2期,并且使細(xì)胞周期蛋白cyclinD1的表達(dá)明顯增加。相反,轉(zhuǎn)染miR-543的inhibitor后更多的細(xì)胞停滯在了G1期,細(xì)胞周期蛋白cyclinD1的表達(dá)也受到顯著抑制。在BGC-823細(xì)胞中共同轉(zhuǎn)染miR-543mimics和SIRT1表達(dá)載體后,SIRT1的表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-543促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程的作用,并且恢復(fù)了細(xì)胞周期蛋白cyclinD1的表達(dá)。6.在組織水平上,我們通過qRT-PCR方法檢測在胃癌組織及癌旁組織標(biāo)本中候選miRNA與SIRT1的表達(dá)水平,并分析候選miRNA與SIRT1表達(dá)水平的相關(guān)性,以及候選miRNA表達(dá)與病人臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系。結(jié)果表明：與正常癌旁組織相比,胃癌中miR-543是高表達(dá)的、SIRT1是低表達(dá)的,而且miR-543的表達(dá)與SIRT1的表達(dá)呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。對患者臨床病理特征進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)：miR-543的表達(dá)與患者的腫瘤大小、臨床分期、TNM分期和淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),與患者的性別、年齡和腫瘤浸潤無關(guān)。結(jié)論：1.miR-543通過與SIRT1 mRNA 3'-UTR區(qū)兩個不同位點相結(jié)合靶向下調(diào)SIRT1的表達(dá)。2.miR-543通過下調(diào)SIRT1的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖、克隆形成和細(xì)胞周期進(jìn)展。3.miR-543在胃癌組織中高表達(dá),與SIRT1的表達(dá)有明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系,miR-543的表達(dá)和胃癌患者腫瘤大小、臨床分期、TNM分期和淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：胃癌 SIRT1 miR-543
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號說明13-15
• 前言15-17
• 材料和方法17-34
• (1) 實驗材料17-23
• (2) 實驗方法23-34
• 實驗結(jié)果34-45
• 討論45-47
• 參考文獻(xiàn)47-52
• 致謝52-53
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文53-54
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表54

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1 李娟;miR-543通過抑制SIRT1促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展[D];山東大學(xué);2016年

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本文編號：554986