本文關鍵詞：AIF-1調控乳腺癌細胞增殖的分子機制研究

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【摘要】：同種異體移植炎癥因子-1(Allograft inflammatory factor-1,AIF-1)是由147個氨基酸組成的多肽,定位于胞漿,具有鈣離子結合能力的炎癥支架蛋白,主要由激活的巨噬細胞表達和分泌,是一種多功能的細胞因子,廣泛參與到炎癥和免疫相關的多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程,包括器官移植、心血管疾病、免疫應答、自身免疫性疾病、生殖、腫瘤等疾病過程。乳腺癌是危害女性健康的主要惡性腫瘤,其復雜的致病機理仍然不很清楚。越來越多的研究表明,在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中所形成的腫瘤微環(huán)境里,腫瘤相關性巨噬細胞及其分泌的各種細胞因子廣泛參與到了腫瘤的發(fā)生、生長、轉移和免疫逃逸等方面。實驗室前人在研究炎癥因子AIF-1與乳腺腫瘤的相關性時對乳腺癌臨床樣本分析發(fā)現(xiàn)AIF-1在乳腺導管癌中高表達,且與腫瘤的大小成正相關,同時體內和體外實驗均證實上調AIF-1的表達,能夠促進乳腺腫瘤的生長。但是AIF-1調控乳腺癌增殖的具體分子機制和所涉及的信號通路尚不清楚。ADMA28(a disintegrin and metalloproteinase 28)是一種解鏈蛋白-金屬蛋白酶,具有蛋白水解酶的功能,有兩種形式:分泌型(ADAM28s)和膜整合型(ADAM28m)。通過切割多種細胞因子或其復合物(vWF、IGFBP-3、CTGF)激活下游信號通路參與調控體內多種腫瘤的生長、轉移。本論文中,首先通過優(yōu)化rhAIF-1蛋白純化體系,獲得具有生物活性的高純度重組蛋白rhAIF-1,并以MDA-MB-231和MDA-MB-361這兩株乳腺癌細胞系為實驗模型,直接在培養(yǎng)基中添加rhAIF-1后,發(fā)現(xiàn)rhAIF-1能夠促進細胞的增殖且呈現(xiàn)劑量和時間依賴性。將純化的蛋白rhAIF-1用羅丹明標記后與細胞共孵育一段時間,共聚焦成像技術分析發(fā)現(xiàn)這種外源的蛋白能夠穿過細胞膜定位在細胞質中,進一步分析發(fā)現(xiàn)rhAIF-1在細胞質不均等分布,而且AIF-1雖然能夠聚集在細胞核的周圍,但并不能進入細胞核,這提示我們可能有其他因子參與到AIF-1調控細胞增殖的過程。為了找到rhAIF-1可能的相互作用蛋白,我們采用蛋白質免疫共沉淀技術,銀染色后分析發(fā)現(xiàn)在70-100KDa有明顯的特異性條帶,通過質譜分析比對數(shù)據(jù)庫中的序列后,初步確定ADAM28m為rhAIF-1可能的相互作用蛋白。接著,我們再次通過免疫共沉淀技術結合免疫印跡對rhAIF-1與ADAM28m兩者之間的相互作用進行驗證,發(fā)現(xiàn)rhAIF-1能夠免疫沉淀出ADAM28m。進一步研究發(fā)現(xiàn)下調ADAM28m的表達,rhAIF-1促進細胞增殖的現(xiàn)象將被抑制。提示AIF-1可通過與ADAM28m相互作用進而激活下游信號通路參與到了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展進程,為臨床研究及靶向治療提供了新的理論依據(jù)和應對策略。
【關鍵詞】：AIF-1 乳腺癌 增殖 相互作用蛋白
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 緒論10-20
• 1.1 炎癥與腫瘤的發(fā)生10-12
• 1.2 乳腺癌的研究現(xiàn)狀12-14
• 1.3 AIF-1 的研究進展14-17
• 1.4 AIF-1 與腫瘤的發(fā)生17
• 1.5 ADAM28的研究進展17-18
• 1.6 本研究的目的和意義18-20
• 2 實驗材料和儀器20-26
• 2.1 實驗菌株、質粒及細胞20
• 2.2 主要儀器設備20
• 2.3 常用溶液的配制20-26
• 3 實驗原理和方法26-40
• 3.1 重組蛋白rhAIF-1 的表達和純化26-28
• 3.2 SDS-PAGE凝膠電泳28-29
• 3.3 免疫印跡29-31
• 3.4 細胞培養(yǎng)和計數(shù)31-32
• 3.5 細胞熒光染色32-33
• 3.6 免疫沉淀33-34
• 3.7 銀染色34-35
• 3.8 質譜分析35
• 3.9 CCK-8 法檢測細胞增殖35-36
• 3.10干擾質粒的構建36-38
• 3.11 電穿孔法細胞轉染38-40
• 4 結果與討論40-55
• 4.1 實驗結果40-52
• 4.2 討論52-55
• 5 全文總結55-57
• 5.1 本論文的創(chuàng)新點55
• 5.2 展望55-57
• 致謝57-58
• 參考文獻58-64
• 附錄 主要符號和縮略詞表64

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