本文關(guān)鍵詞：非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中eEF2K與細(xì)胞自噬和死亡關(guān)系的研究

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【摘要】：真核延伸因子2激酶(eEF2K)是一種Ca2+/CaM依賴性蛋白激酶,eEF2是其已知的唯一底物。eEF2K催化eEF2的Thr56位點(diǎn)發(fā)生磷酸化,導(dǎo)致降低eEF2與核糖體的結(jié)合能力進(jìn)而抑制肽鏈延伸。通過近幾年的研究發(fā)現(xiàn),許多類型的癌細(xì)胞中均呈現(xiàn)eEF2K高表達(dá)或高度活化,尤其是在膠質(zhì)瘤、乳腺癌中最為明顯。eEF2K表達(dá)水平或者活性的改變還將影響細(xì)胞的許多生理進(jìn)程,例如,細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡以及自噬等。其中eEF2K活性水平的改變與細(xì)胞自噬進(jìn)程的調(diào)控又是其中的熱點(diǎn),在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和乳腺癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)eEF2K活性增強(qiáng)能夠誘導(dǎo)自噬,抑制eEF2K活性誘導(dǎo)的自噬能夠增加多種藥物的有效性。到目前為止對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中eEF2K的研究還基本處于空白階段。吉非替尼為為EGFR酪氨酸激酶抑制劑的代表藥物,也是臨床上常用的治療非小細(xì)胞肺癌的藥物,但是隨著作用時(shí)間的延長會(huì)逐漸出現(xiàn)耐藥,限制了吉非替尼的應(yīng)用。本課題目的：旨在觀察在非小細(xì)胞肺癌中eEF2K是否與細(xì)胞自噬和死亡存在聯(lián)系并研究eEF2K是否參與吉非替尼的耐藥,為將來eEF2K作為抗腫瘤靶標(biāo)提供更加充實(shí)的證據(jù)。第一部分非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中吉非替尼誘導(dǎo)eEF2K活化與細(xì)胞自噬在本部分實(shí)驗(yàn)中采用吉非替尼處理非小細(xì)胞肺癌發(fā)現(xiàn),吉非替尼能夠顯著增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌株H1975和A549中eEF2K的活性且具有一定的時(shí)間和劑量依賴性。通過免疫沉淀對(duì)自噬相關(guān)蛋白LC3和P62檢測(cè)、免疫熒光檢測(cè)自噬體顆粒狀的形成以及通過透射電鏡對(duì)自噬體形成的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)吉非替尼能夠?qū)е路切〖?xì)胞肺癌中自噬活性且具有時(shí)間和劑量依賴性。而且還發(fā)現(xiàn)由吉非替尼引起的eEF2K活性增加以及自噬活性增強(qiáng)在時(shí)間和濃度上存在一致性,表明兩者可能存在某種聯(lián)系。第二部分非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中eEF2K與細(xì)胞自噬和死亡關(guān)系的研究1、抑制eEF2K舌性或干擾其表達(dá)后對(duì)由吉非替尼引發(fā)自噬的影響通過貧血清方法測(cè)定A484954在非小細(xì)胞肺癌中抑制eEF2K最適作用濃度100uM以及最適作用時(shí)間為6h,然后通過采用eEF2K小分子抑制劑以及加入其干擾片段抑制eEF2K的活性或者表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)對(duì)由吉非替尼引起的自噬沒有影響。并且通過對(duì)同樣能夠引起非小細(xì)胞肺癌株中eEF2K活性升高以及白噬活性增強(qiáng)的化合物Stattic試驗(yàn),也得出同樣的結(jié)論。2、吉非替尼引起的自噬和eEF2K活性對(duì)細(xì)胞生存的影響eEF2K的抑制并不能對(duì)由吉非替尼引起的自噬產(chǎn)生影響,接下來分別對(duì)由吉非替尼引起的eEF2K舌性升高、自噬活性增強(qiáng)及細(xì)胞生存能力情況三者進(jìn)行探討。發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌株中通過3-MA抑制自噬的活性能夠明顯增強(qiáng)吉非替尼的藥效,而通過A484954抑制eEF2K活性或者干擾其表達(dá)后在吉非替尼處于高濃度的情況下能夠降低吉非替尼的藥效,使得細(xì)胞生存能力增強(qiáng)且這種增強(qiáng)作用在提前將eEF2K舌性抑制后效果更為明顯。3、eEF2K在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中的作用及作用機(jī)制初探在無吉非替尼作用下,通過A549細(xì)胞干擾eEF2K后細(xì)胞計(jì)數(shù)和平板克隆發(fā)現(xiàn)eEF2K被抑制以后能夠?qū)е录?xì)胞生存能力的增加,并能夠引起自噬活性的增強(qiáng)。而在乳腺癌細(xì)胞中eEF2K被抑制可以減少自噬并抑制乳腺癌細(xì)胞生長。通過本研究我們初步明確了抑制eEF2K對(duì)吉非替尼引起的自噬無明顯影響和導(dǎo)致細(xì)胞存活增加的原因可能是在非小細(xì)胞肺癌中eEF2K自身可抑制細(xì)胞自噬與細(xì)胞增殖。意義：通過本課題研究確定了在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中eEF2K不參與吉非替尼介導(dǎo)的耐藥并且還發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中抑制eEF2K還能夠?qū)е录?xì)胞自噬活性增強(qiáng)以及生存能力提高,表明eEF2K在不同腫瘤細(xì)胞中的作用存在差異,這為將來有針對(duì)性地應(yīng)用和開發(fā)有效的靶向eEF2K的藥物奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：吉非替尼 eEF2K 自噬
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 前言12-19
• 1 eEF2K概述12-16
• 1.1 eEF2K的分子結(jié)構(gòu)13
• 1.2 eEF2K的調(diào)控13-15
• 1.2.1 自身磷酸化對(duì)eEF2K活性的影響13-14
• 1.2.2 其他位點(diǎn)磷酸化對(duì)eEF2K活性的調(diào)控14-15
• 1.3 eEF2K一個(gè)潛在的抗腫瘤靶點(diǎn)15-16
• 1.3.1 抑制eEF2K增強(qiáng)藥物的抗腫瘤活性15
• 1.3.2 eEF2K的抑制劑的研究進(jìn)展15-16
• 2 細(xì)胞自噬16-17
• 3 吉非替尼與耐藥17-19
• 第一部分 非小細(xì)胞肺癌中吉非替尼誘導(dǎo)eEF2K活化與自噬19-35
• 引言19
• 1 實(shí)驗(yàn)材料19-23
• 1.1 實(shí)驗(yàn)藥品19
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑19-20
• 1.3 耗材20
• 1.4 抗體20
• 1.5 儀器20-21
• 1.6 常用溶液配制方法21-23
• 1.7 細(xì)胞株和細(xì)胞23
• 2 實(shí)驗(yàn)方法23-28
• 2.1 測(cè)定吉非替尼處理后NSCLC中eEF2K活性23-25
• 2.1.1 測(cè)定吉非替尼處理后H1975和A549這兩種NSCLC的細(xì)胞活力23-24
• 2.1.2 測(cè)定吉非替尼處理后H1975細(xì)胞中eEF2K活性24-25
• 2.1.3 測(cè)定吉非替尼處理后A549細(xì)胞中eEF2K活性25
• 2.2 測(cè)定吉非替尼處理后兩種細(xì)胞中自噬活性25-28
• 2.2.1 測(cè)定吉非替尼處理后H1975細(xì)胞中自噬活性25-26
• 2.2.2 測(cè)定吉非替尼處理后A549細(xì)胞中自噬活性26-28
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-32
• 3.1 吉非替尼處理對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞eEF2K活性的影響28-30
• 3.1.1 吉非替尼對(duì)H1975和A549兩種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的增殖抑制作用28
• 3.1.2 吉非替尼處理對(duì)H1975細(xì)胞中eEF2K活性的影響28-29
• 3.1.3 吉非替尼處理對(duì)A549細(xì)胞中eEF2K活性的影響29-30
• 3.2 吉非替尼處理對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中自噬活性的影響30-32
• 3.2.1 吉非替尼處理對(duì)H1975細(xì)胞中自噬活性的影響30
• 3.2.2 吉非替尼處理對(duì)A549細(xì)胞中自噬活性的影響30-32
• 討論32-35
• 第二部分 吉非替尼作用中eEF2K、自噬、細(xì)胞死亡三者關(guān)系研究35-62
• 引言35-36
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料36-40
• 1.1 實(shí)驗(yàn)藥品36
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑36
• 1.3 耗材36-37
• 1.4 抗體37
• 1.5 儀器37
• 1.6 常用溶液配制方法37-40
• 1.7 細(xì)胞株和細(xì)胞40
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法40-49
• 2.1 抑制eEF2K活性或干擾其表達(dá)后吉非替尼引起的自噬活性的測(cè)定40-44
• 2.1.1 確定A484954最適作用時(shí)間以及最適作用濃度40-42
• 2.1.2 檢測(cè)A484954與吉非替尼聯(lián)合作用后兩種NSCLC細(xì)胞系中自噬活性42-43
• 2.1.3 將eEF2K干擾后檢測(cè)由吉非替尼引起的NSCLC細(xì)胞自噬活性43-44
• 2.2 檢測(cè)A484954與Stattic聯(lián)合作用后兩種NSCLC細(xì)胞系中自噬活性44
• 2.2.1 檢測(cè)Stattic處理后H1975細(xì)胞中eEF2K活性以及自噬活性44
• 2.2.2 檢測(cè)A484954和Stattic聯(lián)合作用后兩種NSCLC細(xì)胞系中自噬活性44
• 2.3 檢測(cè)吉非替尼和A484954聯(lián)合作用后NSCLC細(xì)胞系增殖能力44-47
• 2.3.1 檢測(cè)兩者同時(shí)作用后NSCLC細(xì)胞系增殖能力44-45
• 2.3.2 檢測(cè)兩者序貫給藥后NSCLC細(xì)胞系增殖能力45
• 2.3.3 敲除eEF2K后給藥檢測(cè)NSCLC細(xì)胞系增殖能力45-47
• 2.4 抑制吉非替尼引起的自噬活性對(duì)NSCLC細(xì)胞系中凋亡水平的檢測(cè)47
• 2.5 敲除eEF2K后檢測(cè)NSCLC細(xì)胞系生存能力47-48
• 2.6 初步探討eEF2K敲除后促進(jìn)NSCLC細(xì)胞系生存能力的機(jī)制48-49
• 2.7 用乳腺癌細(xì)胞系MCF-7以及MDB-MB-231細(xì)胞對(duì)eEF2K敲除后對(duì)細(xì)胞自噬能力的影響進(jìn)行驗(yàn)證49
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果49-59
• 3.1 抑制eEF2K活性或干擾其表達(dá)對(duì)由吉非替尼引起自噬活性的影響49-53
• 3.1.1 確定A484954最適作用時(shí)間以及最適作用濃度49-51
• 3.1.2 A484954與吉非替尼聯(lián)合作用對(duì)兩種NSCLC細(xì)胞中eEF2K活性與自噬活性關(guān)系的影響51-52
• 3.1.3 通過SiRNA敲除eEF2K對(duì)由吉非替尼引起NSCLC細(xì)胞自噬活性的影響52-53
• 3.2 A484954與Stattic聯(lián)合作用對(duì)兩種NSCLC細(xì)胞系中eEF2K活性與自噬活性關(guān)系的影響53-54
• 3.2.1 Stattic作用于H1975細(xì)胞對(duì)eEF2K及自噬活性的影響53-54
• 3.2.2 A484954和Stattic聯(lián)合作用對(duì)兩種NSCLC細(xì)胞系中eEF2K活性與自噬的關(guān)系影響54
• 3.3 抑制吉非替尼引起的eEF2K活性對(duì)NSCLC細(xì)胞系生存能力的影響54-57
• 3.3.1 吉非替尼和A484954同時(shí)作用對(duì)NSCLC細(xì)胞系生存能力的影響54-55
• 3.3.2 兩者序貫給藥對(duì)NSCLC細(xì)胞系生存能力的影響55-56
• 3.3.3 干擾eEF2K后給藥對(duì)NSCLC細(xì)胞系生存能力的影響56
• 3.3.4 吉非替尼引起的自噬活性保護(hù)NSCLC細(xì)胞系的作用56-57
• 3.4 eEF2K干擾對(duì)NSCLC細(xì)胞系生長與自噬的影響57-59
• 3.4.1 eEF2K干擾對(duì)NSCLC細(xì)胞系生長的影響57-58
• 3.4.2 干擾eEF2K后誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞自噬58
• 3.4.3 干擾eEF2K后對(duì)乳腺癌細(xì)胞自噬能力的影響58-59
• 3.4.4 eEF2K干擾對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長的影響59
• 討論59-62
• 參考文獻(xiàn)62-66
• 致謝66-67
• 個(gè)人簡歷67
• 發(fā)表學(xué)術(shù)論文67

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1 王根柱;非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中eEF2K與細(xì)胞自噬和死亡關(guān)系的研究[D];中國海洋大學(xué);2015年

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