本文關(guān)鍵詞：非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中eEF2K與細(xì)胞自噬和死亡關(guān)系的研究

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【摘要】：真核延伸因子2激酶(eEF2K)是一種Ca2+/CaM依賴性蛋白激酶,eEF2是其已知的唯一底物。eEF2K催化eEF2的Thr56位點發(fā)生磷酸化,導(dǎo)致降低eEF2與核糖體的結(jié)合能力進而抑制肽鏈延伸。通過近幾年的研究發(fā)現(xiàn),許多類型的癌細(xì)胞中均呈現(xiàn)eEF2K高表達或高度活化,尤其是在膠質(zhì)瘤、乳腺癌中最為明顯。eEF2K表達水平或者活性的改變還將影響細(xì)胞的許多生理進程,例如,細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡以及自噬等。其中eEF2K活性水平的改變與細(xì)胞自噬進程的調(diào)控又是其中的熱點,在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和乳腺癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)eEF2K活性增強能夠誘導(dǎo)自噬,抑制eEF2K活性誘導(dǎo)的自噬能夠增加多種藥物的有效性。到目前為止對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中eEF2K的研究還基本處于空白階段。吉非替尼為為EGFR酪氨酸激酶抑制劑的代表藥物,也是臨床上常用的治療非小細(xì)胞肺癌的藥物,但是隨著作用時間的延長會逐漸出現(xiàn)耐藥,限制了吉非替尼的應(yīng)用。本課題目的：旨在觀察在非小細(xì)胞肺癌中eEF2K是否與細(xì)胞自噬和死亡存在聯(lián)系并研究eEF2K是否參與吉非替尼的耐藥,為將來eEF2K作為抗腫瘤靶標(biāo)提供更加充實的證據(jù)。第一部分非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中吉非替尼誘導(dǎo)eEF2K活化與細(xì)胞自噬在本部分實驗中采用吉非替尼處理非小細(xì)胞肺癌發(fā)現(xiàn),吉非替尼能夠顯著增強非小細(xì)胞肺癌株H1975和A549中eEF2K的活性且具有一定的時間和劑量依賴性。通過免疫沉淀對自噬相關(guān)蛋白LC3和P62檢測、免疫熒光檢測自噬體顆粒狀的形成以及通過透射電鏡對自噬體形成的檢測,發(fā)現(xiàn)吉非替尼能夠?qū)е路切〖?xì)胞肺癌中自噬活性且具有時間和劑量依賴性。而且還發(fā)現(xiàn)由吉非替尼引起的eEF2K活性增加以及自噬活性增強在時間和濃度上存在一致性,表明兩者可能存在某種聯(lián)系。第二部分非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中eEF2K與細(xì)胞自噬和死亡關(guān)系的研究1、抑制eEF2K舌性或干擾其表達后對由吉非替尼引發(fā)自噬的影響通過貧血清方法測定A484954在非小細(xì)胞肺癌中抑制eEF2K最適作用濃度100uM以及最適作用時間為6h,然后通過采用eEF2K小分子抑制劑以及加入其干擾片段抑制eEF2K的活性或者表達后,發(fā)現(xiàn)對由吉非替尼引起的自噬沒有影響。并且通過對同樣能夠引起非小細(xì)胞肺癌株中eEF2K活性升高以及白噬活性增強的化合物Stattic試驗,也得出同樣的結(jié)論。2、吉非替尼引起的自噬和eEF2K活性對細(xì)胞生存的影響eEF2K的抑制并不能對由吉非替尼引起的自噬產(chǎn)生影響,接下來分別對由吉非替尼引起的eEF2K舌性升高、自噬活性增強及細(xì)胞生存能力情況三者進行探討。發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌株中通過3-MA抑制自噬的活性能夠明顯增強吉非替尼的藥效,而通過A484954抑制eEF2K活性或者干擾其表達后在吉非替尼處于高濃度的情況下能夠降低吉非替尼的藥效,使得細(xì)胞生存能力增強且這種增強作用在提前將eEF2K舌性抑制后效果更為明顯。3、eEF2K在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中的作用及作用機制初探在無吉非替尼作用下,通過A549細(xì)胞干擾eEF2K后細(xì)胞計數(shù)和平板克隆發(fā)現(xiàn)eEF2K被抑制以后能夠?qū)е录?xì)胞生存能力的增加,并能夠引起自噬活性的增強。而在乳腺癌細(xì)胞中eEF2K被抑制可以減少自噬并抑制乳腺癌細(xì)胞生長。通過本研究我們初步明確了抑制eEF2K對吉非替尼引起的自噬無明顯影響和導(dǎo)致細(xì)胞存活增加的原因可能是在非小細(xì)胞肺癌中eEF2K自身可抑制細(xì)胞自噬與細(xì)胞增殖。意義：通過本課題研究確定了在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中eEF2K不參與吉非替尼介導(dǎo)的耐藥并且還發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中抑制eEF2K還能夠?qū)е录?xì)胞自噬活性增強以及生存能力提高,表明eEF2K在不同腫瘤細(xì)胞中的作用存在差異,這為將來有針對性地應(yīng)用和開發(fā)有效的靶向eEF2K的藥物奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：吉非替尼 eEF2K 自噬
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 前言12-19
• 1 eEF2K概述12-16
• 1.1 eEF2K的分子結(jié)構(gòu)13
• 1.2 eEF2K的調(diào)控13-15
• 1.2.1 自身磷酸化對eEF2K活性的影響13-14
• 1.2.2 其他位點磷酸化對eEF2K活性的調(diào)控14-15
• 1.3 eEF2K一個潛在的抗腫瘤靶點15-16
• 1.3.1 抑制eEF2K增強藥物的抗腫瘤活性15
• 1.3.2 eEF2K的抑制劑的研究進展15-16
• 2 細(xì)胞自噬16-17
• 3 吉非替尼與耐藥17-19
• 第一部分 非小細(xì)胞肺癌中吉非替尼誘導(dǎo)eEF2K活化與自噬19-35
• 引言19
• 1 實驗材料19-23
• 1.1 實驗藥品19
• 1.2 實驗試劑19-20
• 1.3 耗材20
• 1.4 抗體20
• 1.5 儀器20-21
• 1.6 常用溶液配制方法21-23
• 1.7 細(xì)胞株和細(xì)胞23
• 2 實驗方法23-28
• 2.1 測定吉非替尼處理后NSCLC中eEF2K活性23-25
• 2.1.1 測定吉非替尼處理后H1975和A549這兩種NSCLC的細(xì)胞活力23-24
• 2.1.2 測定吉非替尼處理后H1975細(xì)胞中eEF2K活性24-25
• 2.1.3 測定吉非替尼處理后A549細(xì)胞中eEF2K活性25
• 2.2 測定吉非替尼處理后兩種細(xì)胞中自噬活性25-28
• 2.2.1 測定吉非替尼處理后H1975細(xì)胞中自噬活性25-26
• 2.2.2 測定吉非替尼處理后A549細(xì)胞中自噬活性26-28
• 3 實驗結(jié)果28-32
• 3.1 吉非替尼處理對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞eEF2K活性的影響28-30
• 3.1.1 吉非替尼對H1975和A549兩種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的增殖抑制作用28
• 3.1.2 吉非替尼處理對H1975細(xì)胞中eEF2K活性的影響28-29
• 3.1.3 吉非替尼處理對A549細(xì)胞中eEF2K活性的影響29-30
• 3.2 吉非替尼處理對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中自噬活性的影響30-32
• 3.2.1 吉非替尼處理對H1975細(xì)胞中自噬活性的影響30
• 3.2.2 吉非替尼處理對A549細(xì)胞中自噬活性的影響30-32
• 討論32-35
• 第二部分 吉非替尼作用中eEF2K、自噬、細(xì)胞死亡三者關(guān)系研究35-62
• 引言35-36
• 1. 實驗材料36-40
• 1.1 實驗藥品36
• 1.2 實驗試劑36
• 1.3 耗材36-37
• 1.4 抗體37
• 1.5 儀器37
• 1.6 常用溶液配制方法37-40
• 1.7 細(xì)胞株和細(xì)胞40
• 2. 實驗方法40-49
• 2.1 抑制eEF2K活性或干擾其表達后吉非替尼引起的自噬活性的測定40-44
• 2.1.1 確定A484954最適作用時間以及最適作用濃度40-42
• 2.1.2 檢測A484954與吉非替尼聯(lián)合作用后兩種NSCLC細(xì)胞系中自噬活性42-43
• 2.1.3 將eEF2K干擾后檢測由吉非替尼引起的NSCLC細(xì)胞自噬活性43-44
• 2.2 檢測A484954與Stattic聯(lián)合作用后兩種NSCLC細(xì)胞系中自噬活性44
• 2.2.1 檢測Stattic處理后H1975細(xì)胞中eEF2K活性以及自噬活性44
• 2.2.2 檢測A484954和Stattic聯(lián)合作用后兩種NSCLC細(xì)胞系中自噬活性44
• 2.3 檢測吉非替尼和A484954聯(lián)合作用后NSCLC細(xì)胞系增殖能力44-47
• 2.3.1 檢測兩者同時作用后NSCLC細(xì)胞系增殖能力44-45
• 2.3.2 檢測兩者序貫給藥后NSCLC細(xì)胞系增殖能力45
• 2.3.3 敲除eEF2K后給藥檢測NSCLC細(xì)胞系增殖能力45-47
• 2.4 抑制吉非替尼引起的自噬活性對NSCLC細(xì)胞系中凋亡水平的檢測47
• 2.5 敲除eEF2K后檢測NSCLC細(xì)胞系生存能力47-48
• 2.6 初步探討eEF2K敲除后促進NSCLC細(xì)胞系生存能力的機制48-49
• 2.7 用乳腺癌細(xì)胞系MCF-7以及MDB-MB-231細(xì)胞對eEF2K敲除后對細(xì)胞自噬能力的影響進行驗證49
• 3. 實驗結(jié)果49-59
• 3.1 抑制eEF2K活性或干擾其表達對由吉非替尼引起自噬活性的影響49-53
• 3.1.1 確定A484954最適作用時間以及最適作用濃度49-51
• 3.1.2 A484954與吉非替尼聯(lián)合作用對兩種NSCLC細(xì)胞中eEF2K活性與自噬活性關(guān)系的影響51-52
• 3.1.3 通過SiRNA敲除eEF2K對由吉非替尼引起NSCLC細(xì)胞自噬活性的影響52-53
• 3.2 A484954與Stattic聯(lián)合作用對兩種NSCLC細(xì)胞系中eEF2K活性與自噬活性關(guān)系的影響53-54
• 3.2.1 Stattic作用于H1975細(xì)胞對eEF2K及自噬活性的影響53-54
• 3.2.2 A484954和Stattic聯(lián)合作用對兩種NSCLC細(xì)胞系中eEF2K活性與自噬的關(guān)系影響54
• 3.3 抑制吉非替尼引起的eEF2K活性對NSCLC細(xì)胞系生存能力的影響54-57
• 3.3.1 吉非替尼和A484954同時作用對NSCLC細(xì)胞系生存能力的影響54-55
• 3.3.2 兩者序貫給藥對NSCLC細(xì)胞系生存能力的影響55-56
• 3.3.3 干擾eEF2K后給藥對NSCLC細(xì)胞系生存能力的影響56
• 3.3.4 吉非替尼引起的自噬活性保護NSCLC細(xì)胞系的作用56-57
• 3.4 eEF2K干擾對NSCLC細(xì)胞系生長與自噬的影響57-59
• 3.4.1 eEF2K干擾對NSCLC細(xì)胞系生長的影響57-58
• 3.4.2 干擾eEF2K后誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞自噬58
• 3.4.3 干擾eEF2K后對乳腺癌細(xì)胞自噬能力的影響58-59
• 3.4.4 eEF2K干擾對乳腺癌細(xì)胞生長的影響59
• 討論59-62
• 參考文獻62-66
• 致謝66-67
• 個人簡歷67
• 發(fā)表學(xué)術(shù)論文67

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1 王根柱;非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中eEF2K與細(xì)胞自噬和死亡關(guān)系的研究[D];中國海洋大學(xué);2015年

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