本文關(guān)鍵詞：BRAF突變肽核酸鉗制-PCR檢測(cè)法的建立，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年增加,并且先進(jìn)的生物靶向治療主要針對(duì)復(fù)發(fā)患者。大腸癌術(shù)后治療計(jì)劃,美國(guó)FDA和我國(guó)明確指出,在一線和二線化療計(jì)劃的實(shí)施,加入靶向EGFR受體抗體靶向藥物(西妥昔單抗和帕尼單抗)時(shí),需進(jìn)行藥敏基因突變檢測(cè)。國(guó)際大樣本多中心研究表明,同時(shí)進(jìn)行KRAS、BRAF突變檢測(cè),并按此順序串聯(lián)診斷,可最大限度地準(zhǔn)確預(yù)測(cè)患者對(duì)于抗體靶向藥物的敏感性�，F(xiàn)有檢測(cè)方法主要有:經(jīng)典測(cè)序法、Taqman-ARMS、q PCR-HRM和Scorpion-ARMS。雖然DNA測(cè)序?yàn)閲?guó)際公認(rèn)的分子檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn),但其靈敏度較低(10%),有礙其臨床廣泛應(yīng)用。國(guó)外專利技術(shù)蝎形探針ARMS和對(duì)應(yīng)的Taq Man探針?lè)?靈敏度高(0.1%),主要用于各種類型的組織,包括操作,穿刺或內(nèi)窺鏡檢查組織,2小時(shí)即可完成檢測(cè),試劑盒商業(yè)化程度高,臨床認(rèn)可程度高,國(guó)內(nèi)已有試劑盒獲批CFDA。q PCR-HRM其靈敏度尚可(1%),需要較高檔次的Q-PCR儀,多用于研究中,限制了其臨床應(yīng)用。肽核酸(Peptide Nucleic Acid,PNA)是一種在結(jié)構(gòu)上與DNA有些許近似,但是在堿基組成上又有一點(diǎn)不同的核酸,其骨架由2-氨乙基甘氨酸代替DNA的磷酸二酯糖后形成了一種遠(yuǎn)比DNA穩(wěn)定的核酸。PNA十分穩(wěn)定,正確配對(duì)的DNA/PNA的穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于相應(yīng)的DNA/DNA,同時(shí)在PCR反應(yīng)過(guò)程中PNA不可作為T(mén)aq酶的底物,亦不會(huì)被其他酶所降解。對(duì)于錯(cuò)配的PNA/DNA,哪怕只有一個(gè)堿基的錯(cuò)配,也會(huì)造成其融解溫度下降9-10℃左右。目前,肽核酸作為一種非常有用分子生物學(xué)工具已在疾病的診斷、治療等領(lǐng)域得到應(yīng)用。本課題擬在實(shí)驗(yàn)室前期摸索出的肽核酸(PNA)壓制-PCR/KRAS突變檢測(cè)法的基礎(chǔ)上,將核心的PNA鉗制技術(shù)轉(zhuǎn)化應(yīng)用于結(jié)直腸腫瘤組織中BRAF突變的檢測(cè),有效抑制樣本在PCR反應(yīng)中BRAF野生型基因的擴(kuò)增,從而提高突變基因的檢測(cè)靈敏度以及降低檢測(cè)下限。研究目的探索肽核酸(PNA)抑制-PCR/BRAF突變檢測(cè)法的診斷界值及其檢測(cè)下限。研究方法將含BRAF突變的質(zhì)粒/細(xì)胞株DNA和BRAF野生型組織DNA以不同比例(突變/總體:50%,25%,12.5%,6.25%,3.1%,1.6%,0.8%,0.4%,0)混合配制成參考品,獨(dú)立配制10個(gè)批次并分別進(jìn)行PNA-PCR/BRAF突變檢測(cè),整理出BRAF突變CT值及其總體CT值,并計(jì)算ΔCT值(突變CT值-總體CT值),運(yùn)用ROC曲線擬合的ΔCT作為判明BRAF基因突變的最佳診斷界值(Cut-off值),并根據(jù)前者得出對(duì)應(yīng)的檢測(cè)下限。研究結(jié)果陽(yáng)性參考品在不同突變百分率下的突變CT值、ΔCT值與陰性參考品相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),總體CT值與陰性參考品相比無(wú)差異。COLO205細(xì)胞株ROC曲線的曲線下面積(AUC)是0.9,Cut-off值是11.8,敏感度和特異度分別為78.6%和100%,檢測(cè)下限為3.1%;M1質(zhì)粒ROC曲線的AUC是0.974,Cut-off值是12,敏感度和特異度分別達(dá)到92.9%和100%,檢測(cè)下限為1.6%;M2質(zhì)粒ROC曲線的AUC是0.921,Cut-off值是12,敏感度和特異度各自為87.1%與100%,檢測(cè)下限為1.6%。結(jié)論本研究初步建立了含有肽核酸(PNA)的PCR/BRAF基因突變檢測(cè)法的截?cái)嘀岛妥畹蜋z測(cè)限,為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供了重要的參數(shù)。
【關(guān)鍵詞】：BRAF基因 突變 肽核酸酸類 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.34;R730.43
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 中英文縮略語(yǔ)表9-10
• 前言10-13
• 第一部分 實(shí)驗(yàn)中涉及的質(zhì)粒與細(xì)胞株/組織DNA關(guān)于BRAF突變位點(diǎn)的測(cè)序13-19
• 一、材料與方法13-16
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果16-18
• 三、討論18-19
• 第二部分BRAF突變肽核酸(PNA)鉗制—PCR檢測(cè)法的建立19-30
• 一、材料與方法19-23
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果23-29
• 三、討論29-30
• 全文總結(jié)30-31
• 綜述 131-37
• 綜述 237-43
• 全文參考文獻(xiàn)43-56
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況56-57
• 在讀期間發(fā)表論文56
• 參加科研工作情況56-57
• 致謝57

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 傅新暉;鄧艷紅;范新娟;駱衍新;陳典克;王磊;蘭平;劉煥亮;汪建平;;利用高分辨率熔解曲線分析法檢測(cè)結(jié)直腸癌中KRAS基因突變[J];中華普通外科學(xué)文獻(xiàn)(電子版);2009年05期

  本文關(guān)鍵詞：BRAF突變肽核酸鉗制-PCR檢測(cè)法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：510123