本文關(guān)鍵詞：沉默UBC9對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖與凋亡的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:檢測(cè)泛素結(jié)合酶9(ubiquitin conjugating enzymes 9,UBC9)在肝癌細(xì)胞中的表達(dá),并采用shRNA方法研究下調(diào)UBC9后的肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的改變及其可能的機(jī)制。方法:1、采用蛋白印跡(Western Blot)技術(shù)檢測(cè)人肝癌細(xì)胞株HepG2、LM3、MHCC97h、Huh7、SMMC-7721中UBC9的表達(dá)。2、設(shè)計(jì)并合成針對(duì)UBC9的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)質(zhì)粒,采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體技術(shù)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)設(shè)置正常肝癌細(xì)胞組、脂質(zhì)體組、空載質(zhì)粒(NC-shRNA)組以及目的質(zhì)粒(UBC9-shRNA)組。3、采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real Time-PCR,qRT-PCR)和蛋白印跡(Western Blot)技術(shù)分別檢測(cè)各組細(xì)胞UBC9在轉(zhuǎn)染前后mRNA及蛋白水平的表達(dá)。4、采用CCK8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后肝癌細(xì)胞增殖能力的變化,通過(guò)Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后肝癌細(xì)胞凋亡的變化。5、采用蛋白印跡(Western Blot)技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中Bcl-2以及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平的改變。結(jié)果:1、在HepG2、LM3、MHCC97h、Huh7、SMMC-7721這5種肝癌細(xì)胞株中UBC9蛋白表達(dá)均呈陽(yáng)性高表達(dá),UBC9表達(dá)量最高的是MHCC97h、最低的是LM3,HepG2、SMMC-7721、Huh7這3中細(xì)胞中UBC9表達(dá)量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2、目的質(zhì)粒UBC9-shRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞24h及48h后,UBC9在mRNA水平(24h)以及蛋白水平(48h)相比較正常肝癌細(xì)胞組、脂質(zhì)體組及空載質(zhì)粒組均下降。3、CCK8法顯示UBC9-shRNA組肝癌細(xì)胞的增殖能力明顯下降,流式細(xì)胞儀顯示UBC9-shRNA組肝癌細(xì)胞的凋亡水平最高。4、Western Blot技術(shù)顯示,相比較正常肝癌細(xì)胞組、脂質(zhì)體組及NC-shRNA組,UBC9-shRNA組中Bcl-2蛋白水平明顯下降,NF-κB p65蛋白水平下降。結(jié)論:1、在肝癌細(xì)胞中UBC9為陽(yáng)性高表達(dá),本實(shí)驗(yàn)旨在研究肝癌細(xì)胞增殖與凋亡的變化,故選取HepG2肝癌細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2、目的質(zhì)粒UBC9-shRNA能夠下調(diào)肝癌細(xì)胞中UBC9的表達(dá),下調(diào)UBC9后的肝癌細(xì)胞增殖能力下降,細(xì)胞的凋亡增加。3、下調(diào)UBC9后,可能通過(guò)Bcl-2調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的凋亡改變,可能通過(guò)NF-κB p65調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞增殖的改變。
【關(guān)鍵詞】：UBC9 肝癌 shRNA 增殖 凋亡
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英文縮略詞表9-10
• 第1章 引言10-12
• 第2章 材料與方法12-24
• 2.1 實(shí)驗(yàn)所需材料12-16
• 2.1.1 細(xì)胞株12
• 2.1.2 主要試劑12-13
• 2.1.3 主要設(shè)備13-14
• 2.1.4 主要試劑配制14-16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法16-24
• 2.2.1 UBC9在肝癌細(xì)胞的表達(dá)16-18
• 2.2.2 shRNA設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞轉(zhuǎn)染18-20
• 2.2.3 qRT-PCR、Western Blot分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組UBC9 mRNA和蛋白水平的表達(dá)。20-22
• 2.2.4 CCK8法檢測(cè)定UBC9對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖作用22
• 2.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率22
• 2.2.6 沉默UBC9對(duì)NF-κB p65蛋白及Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響22-23
• 2.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法23-24
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-30
• 3.1 UBC9在5種不同肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)24
• 3.2 轉(zhuǎn)染shRNA后UBC9在HepG2中mRNA及蛋白水平都下調(diào)24-26
• 3.2.1 轉(zhuǎn)染效果24-25
• 3.2.2 轉(zhuǎn)染shRNA后UBC9在HepG2中mRNA水平下調(diào)25
• 3.2.3 轉(zhuǎn)染shRNA后UBC在HepG2中蛋白水平下調(diào)25-26
• 3.3 下調(diào)UBC9能夠抑制HepG2細(xì)胞增殖能力26-27
• 3.4 下調(diào)UBC9能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡27-28
• 3.5 下調(diào)UBC9對(duì)HepG2細(xì)胞中凋亡蛋白Bcl-2 影響28
• 3.6 下調(diào)UBC9對(duì)HepG2細(xì)胞中NF-κB p65的影響28-30
• 第4章 討論30-32
• 第5章 結(jié)論與展望32-33
• 5.1 結(jié)論32
• 5.2 展望32-33
• 致謝33-34
• 參考文獻(xiàn)34-36
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果36-37
• 綜述37-46
• 參考文獻(xiàn)44-46

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本文編號(hào)：491765