本文關鍵詞：蜂毒肽與基因變構IL-2融合蛋白在腫瘤細胞中的表達及生物學活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的構建融合基因蜂毒肽(melittin)與人變構白介素-2[M-IL-2(88Arg,125Ala)]表達載體,驗證構建成功后將重組基因轉染進宮頸癌He La細胞,神經膠質瘤U87細胞,檢測融合基因[M-IL-2(88Arg,125Ala)]在這兩種細胞中的表達以及檢測重組蛋白對宮頸癌He La細胞,神經膠質瘤U87細胞的影響,為蜂毒肽和白介素2在腫瘤方面的基因治療提供實驗基礎。方法設計PCR擴增引物,并在引物上添加相應的酶切位點,以p PICZαA/M-IL-2(88Arg,125Ala)為模板,使用PCR方法,獲得實驗所需要的M-IL-2目的片段。以p LEGFP-C1和p EGFP-N3為載體構建M-IL-2融合基因的真核表達載體p LEGFP-C1-M-IL-2(88Arg,125Ala),p EGFP-N3-M-IL-2(88Arg,125Ala)。使用質粒提取試劑盒提取重組質粒,采用雙酶切和DNA序列的方法鑒定重組質粒,鑒定成功后,使用Lipofectamine 2000脂質體將重組質粒轉染進宮頸癌He La細胞和神經膠質瘤細胞U87中。M-IL-2融合蛋白在宮頸癌He La細胞和神經膠質瘤U87細胞中的表達采用RT-PCR及Western blot的方法進行檢測,表達驗證成功后使用CCK-8的方法及流式細胞儀檢測融合蛋白的生活學活性,檢測其對宮頸癌He La細胞和神經膠質瘤U87細胞增殖和凋亡的影響。結果重組質粒p LEGFP-C1-M-IL-2(88Arg,125Ala),p EGFP-N3-M-IL-2(88Arg,125Ala)經過酶切及DNA測序證實構建成功,經過RT-PCR及Western blot檢測證實重組基因M-IL-2(88Arg,125Ala)可在宮頸癌細胞He La,神經膠質瘤細胞U87中表達,經過CCK-8實驗及細胞流式儀分析融合蛋白在細胞內的表達對以上兩種腫瘤細胞的增殖具有一定的抑制作用。結論真核表達載體pLEGFP-C1-M-IL-2(88Arg,125Ala),pEGFP-N3-M-IL-2(88Arg,125Ala)構建成功,融合基因M-IL-2(88Arg,125Ala)可在He La細胞和U87細胞中表達且融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)對宮頸癌細胞He La,神經膠質瘤細胞U87增殖具有一定的抑制作用,對Hela細胞的凋亡具有一定的促進作用,為融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)的進一步研究提供了實驗基礎。
【關鍵詞】：白介素2 蜂毒肽 融合蛋白 真核表達 生物活性
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R73-3
【目錄】：

• 摘要2-3
• abstract3-6
• 引言6-8
• 第一章 材料與儀器8-13
• 1.1 細胞培養(yǎng)及細胞培養(yǎng)8
• 1.2 質粒和菌株8
• 1.3 主要實驗試劑及配制方法8-11
• 1.3.1 主要實驗試劑8-9
• 1.3.2 主要試劑配制方法9-11
• 1.4 實驗儀器和設備11-13
• 第二章 實驗方法13-29
• 2.1 重組質粒的構建13-17
• 2.1.1 引物設計與合成14-16
• 2.1.2 目的基因擴增及載體構建16-17
• 2.2 重組質粒擴增17-18
• 2.2.1 重組質粒轉化大腸桿菌DH5α17-18
• 2.2.2 菌株的保存18
• 2.3 細胞培養(yǎng)18-20
• 2.3.1 細胞復蘇18-19
• 2.3.2 細胞傳代19
• 2.3.3 細胞凍存19-20
• 2.4 腫瘤細胞轉染及轉化效率優(yōu)化20-21
• 2.4.1 腫瘤細胞轉染20-21
• 2.4.2 轉化效率優(yōu)化21
• 2.5 檢測融合基因M-IL-2(88Arg, 125Ala)在mRNA水平的表達21-24
• 2.5.1 細胞總RNA的提取21-22
• 2.5.2 RT-PCR檢測外源基因M-IL-2(88Arg, 125Ala)在mRNA水平的表達22-24
• 2.6 細胞總蛋白的提取、檢測24-27
• 2.6.1 細胞總蛋白的提取24
• 2.6.2 Western-blot檢測目的蛋白24-27
• 2.7 融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)的表達對腫瘤細胞增殖及凋亡的影響27-28
• 2.7.1 CKK-8 檢測融合蛋白表達對腫瘤細胞Hela、U87增殖的影響27-28
• 2.7.2 TUNEL法檢測融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala) 表達對腫瘤細胞Hela凋亡的影響28
• 2.8 統計學分析28-29
• 第三章 結果29-42
• 3.1 重組質粒的構建及鑒定29-32
• 3.1.1 提取重組質粒pPICZαA/M-IL-2(88Arg, 125Ala)并鑒定29-31
• 3.1.2 重組質粒構建及鑒定31-32
• 3.2 細胞培養(yǎng)32-34
• 3.3. 融合蛋白M-IL-2(88Arg, 125Ala)在腫瘤細胞中的表達34-38
• 3.3.1 細胞轉染34-36
• 3.3.2 RT-PCR檢測M-IL-2(88Arg,125Ala)在Hela及U87細胞中m RNA的轉錄36-37
• 3.3.3 Western blot檢測M-IL-2(88Arg, 125Ala)在Hela及U87細胞中的表達37-38
• 3.4 CKK-8、TUNEL法檢測融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)對腫瘤細胞增殖及凋亡的影響38-42
• 3.4.1 CKK-8 檢測融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)對腫瘤細胞增殖的影響38-40
• 3.4.2 TUNEL檢測融合蛋白表達對腫瘤細胞凋亡的影響40-42
• 第四章 討論42-43
• 第五章 結論43-44
• 參考文獻44-47
• 文獻綜述47-55
• 參考文獻53-55
• 攻讀學位期間研究成果55-56
• 致謝56-57

【共引文獻】

中國期刊全文數據庫 前1條

1 王松;苗利光;李海濤;劉艷環(huán);王文昊;安亞雄;馮卓;;重組hIL-2表達載體的構建及在畢赤酵母中的表達[J];特產研究;2012年01期

中國碩士學位論文全文數據庫 前3條

1 侯偉;26肽蜂毒素與基因變構人白細胞介素2嵌合蛋白的原核表達、純化及活性測定[D];青島大學;2004年

2 劉明軍;蜂毒素與基因變構IL-2嵌合蛋白的純化工藝探索和生物學活性研究[D];青島大學;2007年

3 董軍奎;重組蜂毒素-IL2體外活化免疫細胞及殺傷腫瘤細胞的活性研究[D];青島大學;2008年

  本文關鍵詞：蜂毒肽與基因變構IL-2融合蛋白在腫瘤細胞中的表達及生物學活性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：486674