本文關(guān)鍵詞：蜂毒肽與基因變構(gòu)IL-2融合蛋白在腫瘤細胞中的表達及生物學(xué)活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的構(gòu)建融合基因蜂毒肽(melittin)與人變構(gòu)白介素-2[M-IL-2(88Arg,125Ala)]表達載體,驗證構(gòu)建成功后將重組基因轉(zhuǎn)染進宮頸癌He La細胞,神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細胞,檢測融合基因[M-IL-2(88Arg,125Ala)]在這兩種細胞中的表達以及檢測重組蛋白對宮頸癌He La細胞,神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細胞的影響,為蜂毒肽和白介素2在腫瘤方面的基因治療提供實驗基礎(chǔ)。方法設(shè)計PCR擴增引物,并在引物上添加相應(yīng)的酶切位點,以p PICZαA/M-IL-2(88Arg,125Ala)為模板,使用PCR方法,獲得實驗所需要的M-IL-2目的片段。以p LEGFP-C1和p EGFP-N3為載體構(gòu)建M-IL-2融合基因的真核表達載體p LEGFP-C1-M-IL-2(88Arg,125Ala),p EGFP-N3-M-IL-2(88Arg,125Ala)。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒,采用雙酶切和DNA序列的方法鑒定重組質(zhì)粒,鑒定成功后,使用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進宮頸癌He La細胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U87中。M-IL-2融合蛋白在宮頸癌He La細胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細胞中的表達采用RT-PCR及Western blot的方法進行檢測,表達驗證成功后使用CCK-8的方法及流式細胞儀檢測融合蛋白的生活學(xué)活性,檢測其對宮頸癌He La細胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果重組質(zhì)粒p LEGFP-C1-M-IL-2(88Arg,125Ala),p EGFP-N3-M-IL-2(88Arg,125Ala)經(jīng)過酶切及DNA測序證實構(gòu)建成功,經(jīng)過RT-PCR及Western blot檢測證實重組基因M-IL-2(88Arg,125Ala)可在宮頸癌細胞He La,神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U87中表達,經(jīng)過CCK-8實驗及細胞流式儀分析融合蛋白在細胞內(nèi)的表達對以上兩種腫瘤細胞的增殖具有一定的抑制作用。結(jié)論真核表達載體pLEGFP-C1-M-IL-2(88Arg,125Ala),pEGFP-N3-M-IL-2(88Arg,125Ala)構(gòu)建成功,融合基因M-IL-2(88Arg,125Ala)可在He La細胞和U87細胞中表達且融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)對宮頸癌細胞He La,神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U87增殖具有一定的抑制作用,對Hela細胞的凋亡具有一定的促進作用,為融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)的進一步研究提供了實驗基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：白介素2 蜂毒肽 融合蛋白 真核表達 生物活性
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R73-3
【目錄】：

• 摘要2-3
• abstract3-6
• 引言6-8
• 第一章 材料與儀器8-13
• 1.1 細胞培養(yǎng)及細胞培養(yǎng)8
• 1.2 質(zhì)粒和菌株8
• 1.3 主要實驗試劑及配制方法8-11
• 1.3.1 主要實驗試劑8-9
• 1.3.2 主要試劑配制方法9-11
• 1.4 實驗儀器和設(shè)備11-13
• 第二章 實驗方法13-29
• 2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建13-17
• 2.1.1 引物設(shè)計與合成14-16
• 2.1.2 目的基因擴增及載體構(gòu)建16-17
• 2.2 重組質(zhì)粒擴增17-18
• 2.2.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α17-18
• 2.2.2 菌株的保存18
• 2.3 細胞培養(yǎng)18-20
• 2.3.1 細胞復(fù)蘇18-19
• 2.3.2 細胞傳代19
• 2.3.3 細胞凍存19-20
• 2.4 腫瘤細胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)化效率優(yōu)化20-21
• 2.4.1 腫瘤細胞轉(zhuǎn)染20-21
• 2.4.2 轉(zhuǎn)化效率優(yōu)化21
• 2.5 檢測融合基因M-IL-2(88Arg, 125Ala)在mRNA水平的表達21-24
• 2.5.1 細胞總RNA的提取21-22
• 2.5.2 RT-PCR檢測外源基因M-IL-2(88Arg, 125Ala)在mRNA水平的表達22-24
• 2.6 細胞總蛋白的提取、檢測24-27
• 2.6.1 細胞總蛋白的提取24
• 2.6.2 Western-blot檢測目的蛋白24-27
• 2.7 融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)的表達對腫瘤細胞增殖及凋亡的影響27-28
• 2.7.1 CKK-8 檢測融合蛋白表達對腫瘤細胞Hela、U87增殖的影響27-28
• 2.7.2 TUNEL法檢測融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala) 表達對腫瘤細胞Hela凋亡的影響28
• 2.8 統(tǒng)計學(xué)分析28-29
• 第三章 結(jié)果29-42
• 3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定29-32
• 3.1.1 提取重組質(zhì)粒pPICZαA/M-IL-2(88Arg, 125Ala)并鑒定29-31
• 3.1.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定31-32
• 3.2 細胞培養(yǎng)32-34
• 3.3. 融合蛋白M-IL-2(88Arg, 125Ala)在腫瘤細胞中的表達34-38
• 3.3.1 細胞轉(zhuǎn)染34-36
• 3.3.2 RT-PCR檢測M-IL-2(88Arg,125Ala)在Hela及U87細胞中m RNA的轉(zhuǎn)錄36-37
• 3.3.3 Western blot檢測M-IL-2(88Arg, 125Ala)在Hela及U87細胞中的表達37-38
• 3.4 CKK-8、TUNEL法檢測融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)對腫瘤細胞增殖及凋亡的影響38-42
• 3.4.1 CKK-8 檢測融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)對腫瘤細胞增殖的影響38-40
• 3.4.2 TUNEL檢測融合蛋白表達對腫瘤細胞凋亡的影響40-42
• 第四章 討論42-43
• 第五章 結(jié)論43-44
• 參考文獻44-47
• 文獻綜述47-55
• 參考文獻53-55
• 攻讀學(xué)位期間研究成果55-56
• 致謝56-57

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王松;苗利光;李海濤;劉艷環(huán);王文昊;安亞雄;馮卓;;重組hIL-2表達載體的構(gòu)建及在畢赤酵母中的表達[J];特產(chǎn)研究;2012年01期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 侯偉;26肽蜂毒素與基因變構(gòu)人白細胞介素2嵌合蛋白的原核表達、純化及活性測定[D];青島大學(xué);2004年

2 劉明軍;蜂毒素與基因變構(gòu)IL-2嵌合蛋白的純化工藝探索和生物學(xué)活性研究[D];青島大學(xué);2007年

3 董軍奎;重組蜂毒素-IL2體外活化免疫細胞及殺傷腫瘤細胞的活性研究[D];青島大學(xué);2008年

  本文關(guān)鍵詞：蜂毒肽與基因變構(gòu)IL-2融合蛋白在腫瘤細胞中的表達及生物學(xué)活性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：486674