本文關鍵詞：miR-192靶向TCF7基因?qū)侨饬黾毎鲋澈颓忠u的抑制作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景骨肉瘤(osteosarcoma)是較常見的惡性骨腫瘤,主要影響兒童和青少年。骨肉瘤具有較強的遷移能力,導致許多患者死于肺轉(zhuǎn)移。雖然人們在骨肉瘤的治療上投入很多精力,但患者五年生存率仍僅達60%-70%。目前,人們的研究主要集中在后基因組方面,因此,從基因水平上探討骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制,尋找新的診斷和防治方法顯得尤為重要。Micro RNA(mi RNA)是一類保守的內(nèi)源性非編碼小RNA,通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達。mi RNA參與許多生物過程,如細胞的增殖、血管生成、細胞代謝等,其異常表達與腫瘤的發(fā)生及進展密切相關。最新研究報道,mi R-192在多種腫瘤細胞中低表達,如肺癌、直腸癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌和骨肉瘤。然而,關于mi R-192對骨肉瘤細胞生物學行為的影響尚未見報道。因此,探討mi R-192對人骨肉瘤細胞的增殖、凋亡及侵襲遷移的影響,揭示其相關的作用機制,將為骨肉瘤的臨床防治提供新的思路和策略研究目的本實驗通過骨肉瘤患者組織標本,檢測骨肉瘤組織及其癌旁組織中mi R-192及TCF7基因表達差異。采用骨肉瘤U-2OS和MG63細胞,觀察轉(zhuǎn)染mi R-192對骨肉瘤增殖、凋亡及侵襲遷移的影響,并初步探索mi R-192的生物靶標及其調(diào)控機制,為mi RNA在骨肉瘤的防治的作用提供實驗依據(jù)和新靶點。方法1.在鄭州大學第一附屬醫(yī)院(2013年6月至2015年3月期間)收集20例骨肉瘤患者癌組織及其癌旁組織標本,-80°C保存。使用熒光實時定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-q PCR)方法檢測20例骨肉瘤組織及其癌旁組織標本中mi R-192及TCF7基因m RNA的表達水平,并分析二者之間的關系。同時采用免疫印跡法(Western blot)檢測TCF7蛋白的表達水平。2.采用RT-q PCR方法檢測成骨細胞h FOB1.19,骨肉瘤細胞U-2OS和MG63中mi R-192及TCF7基因的m RNA表達水平。3.合成mi R-192 agomir和mi R-192 negative control,并采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其分別轉(zhuǎn)入骨肉瘤細胞U-2OS和MG63中。實驗分組如下:(1)mi R-192組:轉(zhuǎn)染mi R-192 agomir。(2)NC組:轉(zhuǎn)染mi R-192 negative control。(3)Blank組:僅轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體。4.CCK-8法檢測細胞生長實驗和集落形成實驗,觀察mi R-192對骨肉瘤細胞增殖的影響。5.流式細胞術和Caspase酶活性實驗,觀察mi R-192對骨肉瘤細胞凋亡的影響。6.細胞劃痕實驗,觀察mi R-192對骨肉瘤細胞遷移能力的影響。7.Transwell實驗,觀察mi R-192對骨肉瘤細胞遷移和侵襲能力的影響。8.采用Pic Tar、mi Rwalk、Target Scan和mi Randa等生物信息學軟件預測mi R-192的作用靶標。同時構建含有TCF7的3’-UTR區(qū)的野生型和突變型的重組雙熒光素酶報告基因載體,分別將其與mi R-192 agomir或mi R-192 negative control一起共轉(zhuǎn)染入骨肉瘤細胞U-2OS和MG63中,并運用Western blot實驗方法和雙熒光素酶報告實驗證實TCF7是mi R-192的作用靶標。9.Western blot檢測各組細胞轉(zhuǎn)染mi R-192 agomir后,骨肉瘤細胞U-2OS及MG63中細胞周期蛋白C yclin D1,凋亡抑制蛋白Survivin和與侵襲遷移相關的蛋白Snail的表達。結(jié)果1.與癌旁組織相比,骨肉瘤組織中,mi R-192的表達明顯降低(P0.01),TCF7m RNA的水平明顯升高(P0.01),并且mi R-192的表達與TCF7 m RNA的水平呈負相關。此外,骨肉瘤組織中TCF7的蛋白表達也高于癌旁組織。2.骨肉瘤細胞U-2OS和MG63中,mi R-192的表達明顯低于成骨細胞h FOB1.19(P0.01),TCF7 m RNA表達明顯高于成骨細胞h FOB1.19(P0.01)。3.轉(zhuǎn)染mi R-192 agomir后,mi R-192轉(zhuǎn)染組的mi R-192表達水平顯著高于NC組和Blank組,其差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。表明骨肉瘤細胞轉(zhuǎn)染mi R-192后,骨肉瘤細胞的mi R-192表達水平明顯上調(diào)。4.CCK-8(Cell Counting K it)生長實驗和集落形成結(jié)果顯示,與NC組和Blank組比較,mi R-192組的骨肉瘤細胞在OD450處的吸光度值明顯下降,集落形成數(shù)目也明顯減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),而NC組和Blank組間比較骨肉瘤細胞的吸光度和集落形成數(shù)目無顯著性差異(P0.05)。5.流式細胞術檢測細胞凋亡實驗和Caspase-3酶活性檢測實驗結(jié)果顯示,與NC組和Blank組比較,mi R-192組骨肉瘤細胞的細胞凋亡率和Caspase-3酶活性均明顯升高,其差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),而NC組和Blank組間比較骨肉瘤細胞的凋亡數(shù)和Caspase-3活性無顯著性差異(P0.05)。6.Transwell實驗結(jié)果顯示,與NC組和Blank組相比較,mi R-192組的骨肉瘤細胞穿過基底膜的細胞數(shù)明顯減少,其差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),而NC組和Blank組間比較穿過基底膜的骨肉瘤細胞數(shù)無顯著性差異(P0.05)。7.劃痕實驗結(jié)果提示,與NC組和Blank組比較,mi R-192組細胞的遷移能力明顯降低,而NC組和Blank組間比較細胞的遷移能力無顯著性差異。8.Western blot和雙熒光素酶報告實驗結(jié)果提示,TCF7是mi R-192的作用靶標。9.Western blot結(jié)果提示,轉(zhuǎn)染mi R-192 agomir后,與NC組和Blank組比較,mi R-192組中,細胞周期蛋白Cyclin D1,凋亡抑制蛋白Survivin與侵襲遷移相關的蛋白Snail的表達均下降,而NC組與Blank組比較,細胞中Cyclin D1,Survivin和Snail蛋白的表達無差異。結(jié)論1.骨肉瘤組織和細胞中,mi R-192異常低表達,TCF7高表達,二者呈現(xiàn)負相關。2.mi R-192通過作用于TCF7的3’-UTR區(qū)負向調(diào)控其表達,并抑制其下游相關基因Cyclin D1,Survivin和Snail的表達,從而發(fā)揮生物學作用。3.上調(diào)骨肉瘤細胞中mi R-192的表達能夠有效抑制骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和遷移,并促進骨肉瘤細胞的凋亡。
【關鍵詞】：miR-192 TCF7 骨肉瘤 增殖 侵襲
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R738.1
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 1 引言13-15
• 2 材料和方法15-33
• 2.1 材料15-21
• 2.1.1 研究對象15
• 2.1.2 細胞系來源15
• 2.1.3 質(zhì)粒15-17
• 2.1.4 引物17
• 2.1.5 主要試劑17-18
• 2.1.6 主要儀器設備18-19
• 2.1.7 常用試劑配制19-21
• 2.2 實驗方法21-33
• 2.2.1 標本中miR-192的表達檢測21-22
• 2.2.2 標本中TCF7的表達檢測22-24
• 2.2.3 檢測細胞中miR-192和TCF7 mRNA的表達24-25
• 2.2.4 將miR-192轉(zhuǎn)染入骨肉瘤細胞U-2OS和MG6325
• 2.2.5 轉(zhuǎn)染效果檢測25
• 2.2.6 細胞增殖實驗25-26
• 2.2.7 細胞凋亡實驗26-27
• 2.2.8 細胞侵襲實驗27-28
• 2.2.9 細胞劃痕實驗28
• 2.2.10 靶基因預測28
• 2.2.11 Western blot實驗檢測TCF7蛋白的表達28
• 2.2.12 雙熒光素酶報告實驗28-32
• 2.2.13 Western blot實驗檢測TCF7、CyclinD1、Snail和Survivin蛋白表達32
• 2.2.14 統(tǒng)計學分析32-33
• 3 實驗結(jié)果33-43
• 3.1 骨肉瘤組織中miR-192和TCF7的表達及相關性33-34
• 3.2 正常成骨細胞和骨肉瘤細胞中miR-192與TCF7 mRNA的表達34
• 3.3 骨肉瘤細胞的轉(zhuǎn)染效果檢測34
• 3.4 miR-192對骨肉瘤細胞增殖的影響34-35
• 3.5 miR-192對骨肉瘤細胞凋亡的影響35-37
• 3.6 miR-192對骨肉瘤細胞侵襲的影響37-38
• 3.7 miR-192對骨肉瘤細胞遷移能力的影響38
• 3.8 miR-192靶基因的預測38-39
• 3.9 Western blot驗證miR-192的靶基因39
• 3.10 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-192的靶點39-42
• 3.10.1 Pmir-Glo-TCF7重組報告基因載體的構建39-41
• 3.10.2 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果41-42
• 3.11 Western blot檢測TCF7、CyclinD1、Survivin和Snail的表達42-43
• 4 討論43-45
• 5 結(jié)論45-46
• 6 參考文獻46-49
• 綜述49-59
• 參考文獻59
• 參考文獻59-63
• 中英文縮略詞表63-64
• 個人簡歷64-65
• 致謝65

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本文編號：457453