本文關(guān)鍵詞：miR-192靶向TCF7基因?qū)侨饬黾?xì)胞增殖和侵襲的抑制作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景骨肉瘤(osteosarcoma)是較常見(jiàn)的惡性骨腫瘤,主要影響兒童和青少年。骨肉瘤具有較強(qiáng)的遷移能力,導(dǎo)致許多患者死于肺轉(zhuǎn)移。雖然人們?cè)诠侨饬龅闹委熒贤度牒芏嗑?但患者五年生存率仍僅達(dá)60%-70%。目前,人們的研究主要集中在后基因組方面,因此,從基因水平上探討骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,尋找新的診斷和防治方法顯得尤為重要。Micro RNA(mi RNA)是一類(lèi)保守的內(nèi)源性非編碼小RNA,通過(guò)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。mi RNA參與許多生物過(guò)程,如細(xì)胞的增殖、血管生成、細(xì)胞代謝等,其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)。最新研究報(bào)道,mi R-192在多種腫瘤細(xì)胞中低表達(dá),如肺癌、直腸癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌和骨肉瘤。然而,關(guān)于mi R-192對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,探討mi R-192對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲遷移的影響,揭示其相關(guān)的作用機(jī)制,將為骨肉瘤的臨床防治提供新的思路和策略研究目的本實(shí)驗(yàn)通過(guò)骨肉瘤患者組織標(biāo)本,檢測(cè)骨肉瘤組織及其癌旁組織中mi R-192及TCF7基因表達(dá)差異。采用骨肉瘤U-2OS和MG63細(xì)胞,觀察轉(zhuǎn)染mi R-192對(duì)骨肉瘤增殖、凋亡及侵襲遷移的影響,并初步探索mi R-192的生物靶標(biāo)及其調(diào)控機(jī)制,為mi RNA在骨肉瘤的防治的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新靶點(diǎn)。方法1.在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院(2013年6月至2015年3月期間)收集20例骨肉瘤患者癌組織及其癌旁組織標(biāo)本,-80°C保存。使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-q PCR)方法檢測(cè)20例骨肉瘤組織及其癌旁組織標(biāo)本中mi R-192及TCF7基因m RNA的表達(dá)水平,并分析二者之間的關(guān)系。同時(shí)采用免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)TCF7蛋白的表達(dá)水平。2.采用RT-q PCR方法檢測(cè)成骨細(xì)胞h FOB1.19,骨肉瘤細(xì)胞U-2OS和MG63中mi R-192及TCF7基因的m RNA表達(dá)水平。3.合成mi R-192 agomir和mi R-192 negative control,并采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其分別轉(zhuǎn)入骨肉瘤細(xì)胞U-2OS和MG63中。實(shí)驗(yàn)分組如下:(1)mi R-192組:轉(zhuǎn)染mi R-192 agomir。(2)NC組:轉(zhuǎn)染mi R-192 negative control。(3)Blank組:僅轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體。4.CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和集落形成實(shí)驗(yàn),觀察mi R-192對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響。5.流式細(xì)胞術(shù)和Caspase酶活性實(shí)驗(yàn),觀察mi R-192對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響。6.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),觀察mi R-192對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移能力的影響。7.Transwell實(shí)驗(yàn),觀察mi R-192對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。8.采用Pic Tar、mi Rwalk、Target Scan和mi Randa等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)mi R-192的作用靶標(biāo)。同時(shí)構(gòu)建含有TCF7的3’-UTR區(qū)的野生型和突變型的重組雙熒光素酶報(bào)告基因載體,分別將其與mi R-192 agomir或mi R-192 negative control一起共轉(zhuǎn)染入骨肉瘤細(xì)胞U-2OS和MG63中,并運(yùn)用Western blot實(shí)驗(yàn)方法和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)TCF7是mi R-192的作用靶標(biāo)。9.Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-192 agomir后,骨肉瘤細(xì)胞U-2OS及MG63中細(xì)胞周期蛋白C yclin D1,凋亡抑制蛋白Survivin和與侵襲遷移相關(guān)的蛋白Snail的表達(dá)。結(jié)果1.與癌旁組織相比,骨肉瘤組織中,mi R-192的表達(dá)明顯降低(P0.01),TCF7m RNA的水平明顯升高(P0.01),并且mi R-192的表達(dá)與TCF7 m RNA的水平呈負(fù)相關(guān)。此外,骨肉瘤組織中TCF7的蛋白表達(dá)也高于癌旁組織。2.骨肉瘤細(xì)胞U-2OS和MG63中,mi R-192的表達(dá)明顯低于成骨細(xì)胞h FOB1.19(P0.01),TCF7 m RNA表達(dá)明顯高于成骨細(xì)胞h FOB1.19(P0.01)。3.轉(zhuǎn)染mi R-192 agomir后,mi R-192轉(zhuǎn)染組的mi R-192表達(dá)水平顯著高于NC組和Blank組,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。表明骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-192后,骨肉瘤細(xì)胞的mi R-192表達(dá)水平明顯上調(diào)。4.CCK-8(Cell Counting K it)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和集落形成結(jié)果顯示,與NC組和Blank組比較,mi R-192組的骨肉瘤細(xì)胞在OD450處的吸光度值明顯下降,集落形成數(shù)目也明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而NC組和Blank組間比較骨肉瘤細(xì)胞的吸光度和集落形成數(shù)目無(wú)顯著性差異(P0.05)。5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)和Caspase-3酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與NC組和Blank組比較,mi R-192組骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率和Caspase-3酶活性均明顯升高,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),而NC組和Blank組間比較骨肉瘤細(xì)胞的凋亡數(shù)和Caspase-3活性無(wú)顯著性差異(P0.05)。6.Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與NC組和Blank組相比較,mi R-192組的骨肉瘤細(xì)胞穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而NC組和Blank組間比較穿過(guò)基底膜的骨肉瘤細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著性差異(P0.05)。7.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,與NC組和Blank組比較,mi R-192組細(xì)胞的遷移能力明顯降低,而NC組和Blank組間比較細(xì)胞的遷移能力無(wú)顯著性差異。8.Western blot和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,TCF7是mi R-192的作用靶標(biāo)。9.Western blot結(jié)果提示,轉(zhuǎn)染mi R-192 agomir后,與NC組和Blank組比較,mi R-192組中,細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1,凋亡抑制蛋白Survivin與侵襲遷移相關(guān)的蛋白Snail的表達(dá)均下降,而NC組與Blank組比較,細(xì)胞中Cyclin D1,Survivin和Snail蛋白的表達(dá)無(wú)差異。結(jié)論1.骨肉瘤組織和細(xì)胞中,mi R-192異常低表達(dá),TCF7高表達(dá),二者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。2.mi R-192通過(guò)作用于TCF7的3’-UTR區(qū)負(fù)向調(diào)控其表達(dá),并抑制其下游相關(guān)基因Cyclin D1,Survivin和Snail的表達(dá),從而發(fā)揮生物學(xué)作用。3.上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中mi R-192的表達(dá)能夠有效抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,并促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。
【關(guān)鍵詞】：miR-192 TCF7 骨肉瘤 增殖 侵襲
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R738.1
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 1 引言13-15
• 2 材料和方法15-33
• 2.1 材料15-21
• 2.1.1 研究對(duì)象15
• 2.1.2 細(xì)胞系來(lái)源15
• 2.1.3 質(zhì)粒15-17
• 2.1.4 引物17
• 2.1.5 主要試劑17-18
• 2.1.6 主要儀器設(shè)備18-19
• 2.1.7 常用試劑配制19-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-33
• 2.2.1 標(biāo)本中miR-192的表達(dá)檢測(cè)21-22
• 2.2.2 標(biāo)本中TCF7的表達(dá)檢測(cè)22-24
• 2.2.3 檢測(cè)細(xì)胞中miR-192和TCF7 mRNA的表達(dá)24-25
• 2.2.4 將miR-192轉(zhuǎn)染入骨肉瘤細(xì)胞U-2OS和MG6325
• 2.2.5 轉(zhuǎn)染效果檢測(cè)25
• 2.2.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)25-26
• 2.2.7 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)26-27
• 2.2.8 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)27-28
• 2.2.9 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)28
• 2.2.10 靶基因預(yù)測(cè)28
• 2.2.11 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TCF7蛋白的表達(dá)28
• 2.2.12 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)28-32
• 2.2.13 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TCF7、CyclinD1、Snail和Survivin蛋白表達(dá)32
• 2.2.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析32-33
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-43
• 3.1 骨肉瘤組織中miR-192和TCF7的表達(dá)及相關(guān)性33-34
• 3.2 正常成骨細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞中miR-192與TCF7 mRNA的表達(dá)34
• 3.3 骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果檢測(cè)34
• 3.4 miR-192對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響34-35
• 3.5 miR-192對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響35-37
• 3.6 miR-192對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲的影響37-38
• 3.7 miR-192對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移能力的影響38
• 3.8 miR-192靶基因的預(yù)測(cè)38-39
• 3.9 Western blot驗(yàn)證miR-192的靶基因39
• 3.10 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-192的靶點(diǎn)39-42
• 3.10.1 Pmir-Glo-TCF7重組報(bào)告基因載體的構(gòu)建39-41
• 3.10.2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-42
• 3.11 Western blot檢測(cè)TCF7、CyclinD1、Survivin和Snail的表達(dá)42-43
• 4 討論43-45
• 5 結(jié)論45-46
• 6 參考文獻(xiàn)46-49
• 綜述49-59
• 參考文獻(xiàn)59
• 參考文獻(xiàn)59-63
• 中英文縮略詞表63-64
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷64-65
• 致謝65

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 李繼慶;高危骨肉瘤的研究進(jìn)展[J];中國(guó)矯形外科雜志;2003年13期

2 胡牧,錢(qián)光,梅炯,蔡宣松;骨肉瘤的肺外轉(zhuǎn)移[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).骨科學(xué)分冊(cè);2004年03期

3 劉洪彪,葉小娟,占宏偉,孫達(dá);骨肉瘤放射性核素骨顯像50例分析[J];實(shí)用腫瘤雜志;2005年01期

4 周忠;林建華;;骨肉瘤的中西醫(yī)結(jié)合治療研究進(jìn)展[J];甘肅中醫(yī);2006年03期

5 楊茂偉;王加璐;王旭東;羅輯;;X線表現(xiàn)陰性骨肉瘤的早期診斷[J];中國(guó)腫瘤臨床;2008年22期

6 張淑彬;吳朝平;;骨肉瘤患者父母的焦慮狀況調(diào)查分析[J];華西醫(yī)學(xué);2008年06期

7 徐新華;周福祥;;20例兒童骨肉瘤的臨床治療[J];中醫(yī)兒科雜志;2008年02期

8 王建華;林艷;賈衛(wèi)斗;云得才;許英杰;鄭鐵鋼;;骨肉瘤的診斷與治療[J];現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志;2010年30期

9 李毅星;閆文濤;楊本華;;骨肉瘤31例早期診斷分析[J];中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志;2010年11期

10 徐欣華;李曉琴;楊榮;劉芳;康雅瓊;何欣;尚立娜;;血小板衍生生長(zhǎng)因子受體-a在骨肉瘤中的表達(dá)及意義[J];甘肅醫(yī)藥;2012年11期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 許少健;張葆青;劉金文;石宇雄;黃永明;;16例骨肉瘤患者化療期間的相關(guān)心理分析[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)骨傷分會(huì)第四屆第二次會(huì)議論文匯編[C];2007年

2 馬月新;;骨肉瘤化療期間的護(hù)理對(duì)策[A];全國(guó)腫瘤護(hù)理學(xué)術(shù)交流暨專(zhuān)題講座會(huì)議論文匯編[C];2005年

3 陳秋;王達(dá)輝;閔若良;馬巍;;應(yīng)用大段異體骨治療兒童骨肉瘤的初步體會(huì)[A];2007年浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨浙江省抗癌協(xié)會(huì)骨軟腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2007年

4 鄭進(jìn)佑;;骨肉瘤的現(xiàn)代外科治療概況[A];全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)骨傷科專(zhuān)業(yè)委員會(huì)第十二次學(xué)術(shù)年會(huì)浙江省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)骨傷科專(zhuān)業(yè)委員會(huì)第十次學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2004年

5 余寧先;;骨肉瘤病人家屬的心理護(hù)理[A];全國(guó)腫瘤護(hù)理學(xué)術(shù)交流暨專(zhuān)題講座會(huì)議論文匯編[C];2004年

6 汪偉;陳文直;周潔敏;白玲;劉文英;葉慧義;;高強(qiáng)度聚焦超聲治療骨肉瘤的臨床應(yīng)用研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)超聲醫(yī)學(xué)新進(jìn)展學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

7 曹慶選;李文華;曹來(lái)賓;夏寶樞;;中藥治愈骨肉瘤的中醫(yī)研究與影像學(xué)對(duì)照[A];第十次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合影像學(xué)術(shù)研討會(huì)暨全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合影像學(xué)研究與診斷學(xué)習(xí)班資料匯編[C];2009年

8 王英;肖艦;陳曉華;;骨肉瘤病人癌性疼痛的護(hù)理體會(huì)[A];全國(guó)腫瘤護(hù)理學(xué)術(shù)交流暨專(zhuān)題講座會(huì)議論文匯編[C];2003年

9 陳秋;王達(dá)輝;閔若良;馬巍;;大段異體骨治療兒童骨肉瘤的初步應(yīng)用[A];2005'中國(guó)修復(fù)重建外科論壇論文匯編[C];2005年

10 劉巧慧;韓莎莎;;骨肉瘤保肢患者的心理護(hù)理[A];全國(guó)外科、神經(jīng)內(nèi)外科護(hù)理學(xué)術(shù)交流暨專(zhuān)題講座會(huì)議論文匯編[C];2006年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 張中橋;骨肉瘤病理基礎(chǔ)與其MRI表現(xiàn)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2004年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 劉義慶;雄烯二酮衍生物DSTD誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞自噬和減輕其耐藥性的研究[D];山東大學(xué);2015年

2 尚永軍;TIM-3在骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制研究[D];延邊大學(xué);2015年

3 禚文昆;MiR-20a調(diào)節(jié)EGR2對(duì)骨肉瘤的影響[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

4 高琰;CD44在卵巢癌/骨肉瘤進(jìn)展中的作用及上轉(zhuǎn)換納米逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的研究[D];鄭州大學(xué);2016年

5 趙加力;B7-H3在骨肉瘤微環(huán)境中的表達(dá)及其作用機(jī)制[D];蘇州大學(xué);2016年

6 林博川;MicroRNA-184在骨肉瘤阿霉素耐藥中的功能與機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

7 包擁政;miR-664調(diào)控靶基因SOX7促進(jìn)MG-63骨肉瘤細(xì)胞體外侵襲和遷移機(jī)理研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

8 陳斌;miR-664下調(diào)靶基因FOXO4促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞惡性增殖及機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

9 閆廣寧;骨肉瘤干細(xì)胞自我更新的調(diào)控機(jī)制及意義[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2016年

10 程思;S100A9在骨肉瘤中的表達(dá)和對(duì)骨肉瘤功能作用的影響及相關(guān)機(jī)制的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 關(guān)國(guó)鋒;CXCR4靶點(diǎn)近紅外光學(xué)分子成像檢測(cè)骨肉瘤原位及肺轉(zhuǎn)移腫瘤病灶的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 王志濤;CD44s、CD44v6及CD44v9在骨肉瘤、骨巨細(xì)胞瘤及骨軟骨瘤標(biāo)本的表達(dá)及臨床意義[D];吉林大學(xué);2016年

3 榮小麗;LIMK1基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染骨肉瘤耐藥細(xì)胞系的建立及其增殖侵襲能力的研究[D];吉林大學(xué);2016年

4 關(guān)紅亞;miR-192靶向TCF7基因?qū)侨饬黾?xì)胞增殖和侵襲的抑制作用[D];鄭州大學(xué);2016年

5 閆紅衛(wèi);骨肉瘤臨床診治的影像學(xué)檢查優(yōu)化探討[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2016年

6 劉京偉;小兒長(zhǎng)管骨骨毮炎與骨肉瘤影像學(xué)對(duì)比研究[D];山東大學(xué);2016年

7 王坤;GRM4基因多態(tài)性與骨肉瘤的遺傳易感性及臨床病理特征的相關(guān)性研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2016年

8 王汀;骨肉瘤治療研究進(jìn)展[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

9 杜飛舟;骨肉瘤~（31）P磁共振波譜研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2008年

10 張波;43例骨肉瘤患者預(yù)后的多因素分析[D];浙江大學(xué);2010年

  本文關(guān)鍵詞：miR-192靶向TCF7基因?qū)侨饬黾?xì)胞增殖和侵襲的抑制作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：457453