本文關(guān)鍵詞：MiRNA-17-92影響肝癌干細(xì)胞特性及在肝臟損傷中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Micro RNA-17-92基因簇目前研究最多的mi RNA簇,其成員包括mi R-17、mi R-18a、mi R-19a、mi R-19b-1、mi R-20a和mi R-92a-1,參與到包括器官發(fā)育、物質(zhì)代謝、細(xì)胞增殖分化、凋亡和癌變等生物體生命過程的各個環(huán)節(jié)。本研究重點(diǎn)探討micro RNA-17-92對肝癌細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)成球能力、增殖、遷移、凋亡和皮下移植瘤形成等干細(xì)胞特性的影響,以及在體內(nèi)、外化學(xué)性和藥物性肝細(xì)胞損傷中的作用。一、Micro RNA-17-92基因簇對肝癌細(xì)胞干細(xì)胞特性的影響肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)位居世界腫瘤發(fā)病率第五位,腫瘤死亡率第三位。已經(jīng)明確的HCC高危因素是超重和糖尿病,區(qū)域性的乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)爆發(fā)也與HCC的發(fā)病相關(guān)。最新報道發(fā)現(xiàn)的高危因素還包括高齡、酗酒、黃曲霉毒素(aflatoxin)暴露、鐵元素相關(guān)的血色素沉著,還有吸煙,但具體機(jī)制還不明確。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs),又稱腫瘤啟動細(xì)胞(tumor-initiating cells,T-ICs)是腫瘤組織中的一小群干細(xì)胞樣細(xì)胞,具有自我更新和多向分化潛能,是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要因素。近年來,CD133,CD90,Ep CAM,CD24,CD47等多個肝癌干細(xì)胞(liver cancer stem cells,LCSCs)表面標(biāo)志物被鑒定,它們的高表達(dá)對于維持肝癌干細(xì)胞的自我更新、體內(nèi)成瘤、遷移、耐藥等特性至關(guān)重要,并與肝癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。在前期研究中我們利用DEN誘發(fā)小鼠肝癌組織mi RNA表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)HPPCn轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌組織與癌旁組織比較,mi R-17-92在肝癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)。隨后我們檢測了10例人肝細(xì)胞癌組織中mi R-17-92的表達(dá),結(jié)果顯示mi R-17-92在人肝癌組織中表達(dá)明顯增加。本研究利用慢病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)建立mi R-17-92穩(wěn)定高表達(dá)的肝癌細(xì)胞和利用mi RNA inhibitor轉(zhuǎn)染抑制mi R-17-92的表達(dá)的方法,評價其對腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響,為mi R-17-92基因簇參與HCC調(diào)控尋找新的突破。本研究發(fā)現(xiàn)mi R-17-92基因簇可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞干細(xì)胞特性,主要表現(xiàn)在以下幾方面:1)Mi R-17-92過表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞自我更新能力:無血清懸浮培養(yǎng)可以通過形成腫瘤干細(xì)胞球的數(shù)目和大小,實(shí)現(xiàn)從單個細(xì)胞的水平評價CSC自我更新的能力。對mi R-17-92穩(wěn)定高表達(dá)的肝癌細(xì)胞系(97L-17-92OE)和對照細(xì)胞系(97L-NTC)的懸浮培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),接種97L-17-92OE細(xì)胞4天左右,鏡下即可觀察到干細(xì)胞球,培養(yǎng)至1周以上,97L-17-92OE細(xì)胞中干細(xì)胞球數(shù)量明顯多于對照組,且干細(xì)胞球體積大,結(jié)構(gòu)緊實(shí),輕拍培養(yǎng)皿不分散;2)Mi R-17-92過表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移能力:利用含5%血清的DMEM作為遷移誘導(dǎo)液,誘導(dǎo)97L-17-92OE細(xì)胞和對照97L-NTC細(xì)胞的遷移,97L-17-92OE細(xì)胞遷移數(shù)量遠(yuǎn)多于97L-NTC細(xì)胞;3)Mi R-17-92過表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞對sorafenib的耐藥:Annexin-V細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,mi R-17-92過表達(dá)顯著增加了肝癌細(xì)胞對Sorafenib的耐藥能力;4)抑制mi R-17-92表達(dá)能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖:Mi RNA Inhibitor抑制mi R17-92各成員的表達(dá)后,肝癌LM3細(xì)胞的增殖能力降低;5)抑制mi R-17-92表達(dá)抑制了肝癌細(xì)胞的遷移:利用含5%血清的DMEM作為遷移誘導(dǎo)液,誘導(dǎo)抑制mi R-17-92各成員表達(dá)后的LM3細(xì)胞遷移,抑制表達(dá)后的LM3遷移數(shù)少于正常LM3細(xì)胞;6)抑制mi R-17-92表達(dá)抑制了肝癌細(xì)胞的耐藥:抑制肝癌LM3細(xì)胞中mi R-17-92中高表達(dá)成員mi R-92a后,索拉菲尼(Sorafenib)(2.5mol/ml、5mol/ml、10mol/ml、20mol/ml)誘導(dǎo)下的凋亡率升高;7)Mi R-17-92過表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的成瘤率:利用連續(xù)稀釋肝癌細(xì)胞的NOD-SCID小鼠異種移植實(shí)驗(yàn)評價mi R17-92對肝癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤率的影響,結(jié)果顯示接種97L-17-92OE細(xì)胞后形成時間早于97L-NTC組,且腫瘤形成率高,ELDA(Extreme limiting dilution analysis)分析得到97L-17-92OE細(xì)胞中干細(xì)胞頻率為1/48160,高于對照97L-NTC細(xì)胞中的干細(xì)胞數(shù)量�？偨Y(jié)以上結(jié)果,我們得出以下結(jié)論,mi R-17-92基因簇通過提高肝癌細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)干細(xì)胞球形成率,提高肝癌細(xì)胞增殖、遷移能力,提高肝癌細(xì)胞化療藥物耐藥性,以及皮下移植瘤形成率,表現(xiàn)為促進(jìn)肝癌細(xì)胞干細(xì)胞特性。二、Mi RNA-17-92在肝臟損傷中的作用肝臟是維持生命體正常生理活動的重要器官,主要功能是物質(zhì)代謝,儲存糖原,合成分泌性蛋白質(zhì),合成膽汁等。與其他組織器官不同的是,肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞具有迅速核分裂的能力,表現(xiàn)為肝臟旺盛的、活躍的再生能力。臨床觀察發(fā)現(xiàn),人的肝臟部分切除后6個月后可恢復(fù)到切除前大小。這種再生能力不僅表現(xiàn)在肝臟切除后,而且在化學(xué)、藥物中毒和肝炎病毒感染造成肝細(xì)胞損傷時也可發(fā)揮作用。但是這種損傷的修復(fù)是建立在殘存一定數(shù)量正常肝細(xì)胞的基礎(chǔ)之上,如果反復(fù)或持續(xù)的肝損傷,使肝細(xì)胞再生能力下降,則會導(dǎo)致肝纖維化,肝硬化甚至肝癌,例如,黃曲霉毒素之所以能誘發(fā)肝硬化,原因就是其能抑制肝細(xì)胞的有絲分裂,阻止肝細(xì)胞再生。肝臟具有轉(zhuǎn)化體內(nèi)外各類藥物、毒物及代謝產(chǎn)物的作用,但根據(jù)其生理特性,肝臟75%的血來自胃腸道、胰、脾等器官的門靜脈,也極易造成藥物毒物代謝產(chǎn)物等有害物質(zhì)的堆積,造成肝損傷,而肝損傷后代謝能力減弱,有害物質(zhì)持續(xù)堆積,形成惡性循環(huán)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種mi RNAs參與到肝臟損傷和疾病當(dāng)中,例如阿司匹林引起的肝臟損傷中mi R-122和mi R-192的表達(dá)上調(diào),mi R-449a通過CHI3L1靶向調(diào)控NOTCH信號通路參與HCV病毒感染后導(dǎo)致的炎癥和纖維化,但是涉及mi R-17-92的報道還不多,僅有mi R-17-92缺失導(dǎo)致p21和Pten蛋白表達(dá)升高,抑制肝臟再生。本研究利用Alb-cre-loxp系統(tǒng)得到肝臟組織特異mi R-17-92敲除小鼠方法,通過建立CCl4和Con A肝臟損傷模型,評價mi R-17-92基因簇在肝臟損傷中發(fā)揮的作用,為肝臟損傷的防護(hù)和治療提供新的靶點(diǎn)和線索。本研究發(fā)現(xiàn)mi R-17-92基因簇對肝臟損傷起保護(hù)作用,主要表現(xiàn)在以下幾個方面:1)利用mi R-17-92過表達(dá)的正常肝臟細(xì)胞及對照細(xì)胞評價mi R-17-92在CCl4誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷中的作用:利用不同濃度(5、10、15、20、25mmol/l)CCl4處理穩(wěn)定高表達(dá)mi R-17-92的肝細(xì)胞L02-17-92OE和對照細(xì)胞L02-NTC,模擬體外肝細(xì)胞損傷,利用MTS檢測CCl4處理后肝細(xì)胞的存活率。結(jié)果顯示,L02-17-92OE細(xì)胞的存活率高于對照組(P0.05);2)利用肝組織特異的mi R-17-92敲除小鼠及野生小鼠評價了mi R-17-92缺失對急性肝臟損傷的影響:相同周齡雄性mi R17-92肝組織特異性敲除小鼠和野生型小鼠各6只,記為mi R-17-92liver-/-組和WT組,40%CCl4的橄欖油混合液,按照2ml/kg體重的量灌胃,24h后處死,肝臟指數(shù),mi R-17-92liver-/-組5.79±0.23大于WT組3.60±0.44(P0.05),血清ALT指標(biāo),mi R-17-92liver-/-組2862±392.39大于WT組1701.5±239.93(P0.05),AST指標(biāo)mi R-17-92liver-/-組1051.17±791.30大于WT組674.83±120.05(P0.05),組織病理學(xué)HE染色結(jié)果,mi R-17-92liver-/-組肝細(xì)胞壞死廣泛而嚴(yán)重,肝細(xì)胞索解離,肝細(xì)胞溶解,出現(xiàn)彌漫性大片壞死,橋接壞死,肝小葉及匯管區(qū)大量炎細(xì)胞浸潤,WT組匯管區(qū)及中央靜脈周圍大量炎細(xì)胞浸潤,肝腺泡Ⅰ區(qū)肝細(xì)胞呈水樣變性脂肪變性,可見肝細(xì)胞片狀壞死,但肝組織結(jié)構(gòu)仍可見,肝組織損傷評分mi R-17-92liver-/-組得分2.8±0.35大于WT組0.9±0.2(P0.05);3)周齡相同雄性mi R17-92肝組織特異性敲除小鼠和野生型小鼠各6只,記為mi R-17-92liver-/-組和WT組,2.5mg/ml Con A溶液,按15mg/kg的量尾靜脈注射,24h后處死,肝臟指數(shù),mi R-17-92liver-/-組4.92±0.19大于WT組3.31±0.27(P0.05),血清ALT指標(biāo),mi R-17-92liver-/-組11298.17±1727.09大于WT組8399.50±1700.95(P0.05),AST指標(biāo)mi R-17-92liver-/-組為11641±1528.28大于WT組8886.83±1922.56(P0.05),組織病理學(xué)HE染色結(jié)果,mi R-17-92liver-/-組肝組織內(nèi)大量T淋巴細(xì)胞浸潤,在匯管區(qū)尤為明顯,肝竇內(nèi)紅細(xì)胞彌漫性淤積,且可見大量肝細(xì)胞核破裂、凋亡小體、肝細(xì)胞脂肪變性等,點(diǎn)、灶狀壞死區(qū)可見淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤,WT組除肝組織少量淋巴細(xì)胞浸潤外,無明顯異常,肝組織損傷評分mi R-17-92liver-/-組1.9±0.39大于WT組0.2±0.11(P0.05)。總結(jié)以上結(jié)果,我們得出以下結(jié)論,mi R-17-92基因簇可以提升肝癌細(xì)胞的自我更新、增殖、遷移能力,也可以提高肝癌細(xì)胞皮下移植瘤形成率。同時,我們推測mi R-17-92基因簇通過降低肝細(xì)胞對CCl4和Con A的敏感性,在肝臟損傷中起保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：MiRNA17-92 肝癌 干細(xì)胞 肝臟損傷
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 英文縮略詞表4-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-19
• 1.MiR-17-92 基因簇對肝癌干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響15-16
• 2.MiR-17-92 基因簇在肝臟損傷中的作用16-19
• 第一章 MiR-17-92 對肝癌干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響19-37
• 1.實(shí)驗(yàn)材料19-21
• 2.實(shí)驗(yàn)方法21-27
• 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-35
• 4.討論35-37
• 第二章 MiR-17-92 在急性肝臟損傷中的作用37-57
• 1.實(shí)驗(yàn)材料37-40
• 2.實(shí)驗(yàn)方法40-45
• 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-55
• 4.討論55-57
• 結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 代表論著63-78
• 致謝78

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