本文關(guān)鍵詞：基于cell-SELEX技術(shù)的惡性黑色素瘤細(xì)胞高侵襲性適配體篩選，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的]核酸適配體(Aptamer)是一類能特異性識(shí)別靶分子的單鏈DNA或RNA,可利用人工構(gòu)建的隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫(kù),通過(guò)SELEX技術(shù)篩選獲得。SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment,指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化)是一種全新的組合化學(xué)技術(shù)。核酸適配體具有無(wú)免疫原性、性質(zhì)穩(wěn)定、可體外合成、成本低、高特異性等特性。因而成為腫瘤生物標(biāo)記物篩選及分子靶向治療關(guān)注的焦點(diǎn)。惡性黑色素瘤是高死亡率的惡性腫瘤,云南地區(qū)高發(fā)。侵襲轉(zhuǎn)移是黑色素瘤患者主要致死原因。本研究利用cell-SELEX技術(shù),以高侵襲性黑色素瘤細(xì)胞A2058為靶細(xì)胞,以期篩選出侵襲性惡性黑色素瘤相關(guān)的特異性核酸適配體,為轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤分子診斷和靶向治療提供新的候選靶標(biāo)。[方法]本研究以人高侵襲性惡性黑色素瘤細(xì)胞株A2058作為靶細(xì)胞,人永生化上皮細(xì)胞Hacat為對(duì)照細(xì)胞,采用cell-SELEX技術(shù),通過(guò)12輪篩選,富集特異性結(jié)合惡性黑色素瘤細(xì)胞A2058的特異性核酸適配體。同時(shí)利用流式細(xì)胞術(shù),對(duì)篩得的次級(jí)文庫(kù)進(jìn)行流式檢測(cè),驗(yàn)證其與高侵襲性惡性黑色素瘤細(xì)胞A2058的特異性結(jié)合能力。最后,通過(guò)高通量測(cè)序,結(jié)合DNA MEN及oligoanalyzer軟件預(yù)測(cè)核酸適配體序列的結(jié)構(gòu),在體外合成的次級(jí)文庫(kù)中獲取十條核酸適配體序列,再利用流式術(shù)驗(yàn)證其與A2058細(xì)胞的特異性結(jié)合能力。[結(jié)果]1.通過(guò)cell-SELEX平臺(tái)富集適配體文庫(kù)·通過(guò)PCR擴(kuò)增優(yōu)化退火溫度,確定50℃為最佳退火溫度根據(jù)引物Tm值,設(shè)定退火溫度區(qū)間為50℃～65℃。根據(jù)目的條帶的亮度、清晰度、彌散度及非特異性情況選取退火溫度。通過(guò)RT-PCR凝膠電泳發(fā)現(xiàn),在50℃退火溫度下,目的條帶亮度最大,條帶無(wú)彌散且無(wú)明顯非特異性條帶。因此,確定50℃為PCR擴(kuò)增最佳退火溫度�！ねㄟ^(guò)PCR擴(kuò)增優(yōu)化引物濃度,確定5uM為最佳引物濃度在相同的PCR反應(yīng)體系下,設(shè)置不同引物濃度梯度：1μM,2uM,3uM, 4uM,5uM,6uM,7uM,8μM,9uM。根據(jù)目的條帶的亮度、清晰度、彌散度及非特異性情況選取引物濃度。在5uM引物濃度下,目的條帶亮度最大,條帶無(wú)彌散且無(wú)明顯非特異性條帶。因此,確定5uM為PCR擴(kuò)增最佳引物濃度�！�(yōu)化篩選條件,富集最佳適配體文庫(kù)通過(guò)調(diào)整篩選壓力,提高篩選所得核酸適配體的特異性和親和力,同時(shí)利用RT-PCR技術(shù)確定每輪篩選PCR擴(kuò)增最佳循環(huán)數(shù)。在此條件下,經(jīng)過(guò)12輪篩選,獲得了針對(duì)人惡性黑色素瘤細(xì)胞A2058的富集文庫(kù),通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)證實(shí),篩選得到的次級(jí)文庫(kù)可特異性識(shí)別惡性黑色素瘤細(xì)胞A2058,而對(duì)對(duì)照細(xì)胞Hacat無(wú)識(shí)別。2.高通量測(cè)序及核酸適配體的結(jié)構(gòu)信息分析對(duì)第12輪ssDNA文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序,可見(jiàn)文庫(kù)有良好富集。利用DNAMEN和oligoanalyzer軟件對(duì)前20條序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)信息分析,發(fā)現(xiàn)序列一級(jí)結(jié)構(gòu)根據(jù)同源性可分四部分；二級(jí)結(jié)構(gòu)以莖環(huán)結(jié)構(gòu)為主。3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)核酸適配體與細(xì)胞的結(jié)合情況經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證,獲得3條可特異性識(shí)別人惡性黑色素瘤細(xì)胞A2058的核酸適配體序列：Seq7, Seq8, Seq10,研究發(fā)現(xiàn),Seq7, Seq8, Seq10可特異性識(shí)別A2058細(xì)胞,但識(shí)別能力欠佳。[結(jié)論]通過(guò)cell-SELEX技術(shù)可篩選出特異性結(jié)合人惡性黑色素瘤細(xì)胞A2058的核酸適配體。Seq7, Seq8, Seq10可特異性識(shí)別人惡性黑色素瘤細(xì)胞A2058。
【關(guān)鍵詞】：核酸適配體 Cell-SELEX技術(shù) 惡性黑色素瘤 轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.5
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-17
• 材料與方法17-29
• 結(jié)果29-44
• 討論44-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 綜述53-62
• 參考文獻(xiàn)58-62
• 攻讀學(xué)位期間獲得的學(xué)術(shù)成果62-63
• 致謝63-64

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本文編號(hào)：440354