第一部分引言目前,腫瘤是世界第二大致死性疾病,其發(fā)病率和死亡率在持續(xù)增加,世界衛(wèi)生組織最新數(shù)據(jù)顯示,到2020年,預(yù)計(jì)全球癌癥發(fā)病率將增加50%。癌癥的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜且尚不清楚,與基因、環(huán)境等多種因素有關(guān)。最新研究表明,能量代謝紊亂在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,糾正腫瘤能量代謝成為腫瘤治療的新策略。單磷酸腺苷活化蛋白激酶(5’-monophosphate adenosine activated protein kinase,AMPK)為細(xì)胞的能量感受器,近十年發(fā)現(xiàn)可以明顯抑制腫瘤。在腫瘤細(xì)胞中,即使在有氧條件下,糖酵解途徑也是其能量的主要來(lái)源,這一現(xiàn)象被稱(chēng)為Warburg效應(yīng)。最新研究表明,LKB1/AMPK可以調(diào)節(jié)腫瘤的Warburg效應(yīng),但其具體機(jī)制尚不明確。線粒體是細(xì)胞的能量加工廠,所以AMPK與線粒體之間的關(guān)系密不可分。文獻(xiàn)表明,增強(qiáng)線粒體的有氧氧化作用,或抑制糖酵解過(guò)程,對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用,也有文獻(xiàn)報(bào)道,AMPK可以抑制Warburg效應(yīng)。因此我們推測(cè):AMPK可以影響線粒體功能和數(shù)目。為了進(jìn)一步明確其具體作用機(jī)制,我們構(gòu)建了LKB1高表達(dá)細(xì)胞株A549-L...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
中英文縮略詞表
第1部分 前言
    1.1 腫瘤發(fā)病率和死亡率
    1.2 腫瘤細(xì)胞代謝特點(diǎn)
    1.3 AMPK的結(jié)構(gòu)和功能
    1.4 AMPK對(duì)線粒體數(shù)目的調(diào)節(jié)作用
    1.5 AMPK對(duì)線粒體功能的調(diào)節(jié)作用
    1.6 蛋白質(zhì)的降解
    1.7 命題依據(jù)與假設(shè)
第2部分 AMPKα、β亞單位在腫瘤細(xì)胞線粒體中定位及其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
    2.1 材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
        2.2.2 搖菌與質(zhì)粒的提取
        2.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.4 puromycin篩選濃度的確定
        2.2.5 慢病毒mito-AMPK和mito-RFP的包裝
        2.2.6 慢病毒濃縮
        2.2.7 慢病毒感染A549細(xì)胞
        2.2.8 Crispr/Cas9轉(zhuǎn)染
        2.2.9 蛋白樣本獲取
        2.2.10 蛋白濃度檢測(cè)
        2.2.11 Western blot蛋白體系配制
        2.2.12 Western blot檢測(cè)
        2.2.13 細(xì)胞增殖檢測(cè)
        2.2.14 劃痕實(shí)驗(yàn)
        2.2.15 平板克隆實(shí)驗(yàn)
        2.2.16 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 AMPKβ在細(xì)胞內(nèi)的分布及對(duì)腫瘤的抑制作用
        2.3.2 線粒體上AMPKα對(duì)腫瘤的抑制作用
    2.4 討論
第3部分 AMPKα和β對(duì)線粒體的影響
    3.1 材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.2 Western blot 實(shí)驗(yàn)
        3.2.3 線粒體蛋白在總蛋白的比例
        3.2.4 腺病毒感染細(xì)胞
        3.2.5 總RNA提取
        3.2.6 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)
        3.2.7 總DNA提取
        3.2.8 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)
        3.2.9 線粒體活細(xì)胞染色
        3.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 AMPKα和AMPKβ對(duì)線粒體數(shù)目的影響
        3.3.2 AMPKα和AMPKβ對(duì)線粒體生物合成的影響
        3.3.3 AMPKα和AMPKβ對(duì)線粒體分裂融合的影響
    3.4 討論
第4部分 AMPKα和β對(duì)細(xì)胞能量代謝的影響
    4.1 材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        4.2.2 乳酸檢測(cè)
        4.2.3 糖酵解壓力檢測(cè)
        4.2.4 XF24培養(yǎng)板細(xì)胞接種方法
        4.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    4.3 結(jié)果
    4.4 討論
第5部分 AMPKβ對(duì)AMPKα穩(wěn)定性的影響
    5.1 材料
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
        5.1.2 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        5.1.4 實(shí)驗(yàn)方法
        5.1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    5.3 討論
第6部分 AMPKα對(duì)腫瘤細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響
    6.1 材料
        6.1.1 細(xì)胞
        6.1.2 材料
        6.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        6.1.4 實(shí)驗(yàn)方法
    6.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    6.3 討論
第7部分 結(jié)論與展望
    7.1 結(jié)論
    7.2 展望
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間的研究成果
綜述
    參考文獻(xiàn)



本文編號(hào)：4046202