近年來(lái),利用重組病毒對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行基因編輯用于免疫治療,受到了廣泛重視。然而,重組病毒因存在隨機(jī)整合,制備耗時(shí)長(zhǎng)且昂貴的缺點(diǎn)制約了其應(yīng)用。與此同時(shí),電轉(zhuǎn)染技術(shù)的應(yīng)用能夠快速將外源DNA帶入細(xì)胞內(nèi),有助于提高T細(xì)胞基因編輯效率。TET(Ten-eleven translocation)家族蛋白可以催化5-甲基胞嘧啶(5mC)轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶(5hmC),5hmC作為細(xì)胞中的DNA去甲基化酶,在細(xì)胞基因組表觀遺傳學(xué)中起著重要調(diào)控作用。研究表明TET2基因的缺失能夠促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的快速繁殖,產(chǎn)生強(qiáng)力的CAR-T細(xì)胞。該研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)TET2基因進(jìn)行敲除。首先對(duì)sgRNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,與大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)的Cas9蛋白孵育形成Cas9:gRNA核糖核蛋白復(fù)合物(RNP),并在體外酶切驗(yàn)證sgRNA的活性。接著利用電轉(zhuǎn)染技術(shù)將Cas9:gRNA核糖核蛋白復(fù)合物(RNP)帶入細(xì)胞內(nèi),并檢測(cè)T細(xì)胞基因編輯效率。最后利用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞的增殖情況。基因測(cè)序與T7EⅠ酶切結(jié)果表明,T細(xì)胞中的TET2基因被成功敲除,T細(xì)胞活力和功能并未受到影響。流式細(xì)胞技術(shù),...

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圖4T細(xì)胞TET2基因敲除驗(yàn)證

本研究構(gòu)建了攜帶有核定位信號(hào)的Cas9蛋白表達(dá)載體，在大腸桿菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)中誘導(dǎo)Cas9蛋白表達(dá)。由于大腸桿菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)均有操作方便快捷、時(shí)間周期短、獲得蛋白量大等特點(diǎn)，能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的Cas9蛋白。人為在Cas9蛋白C端融合表達(dá)了6個(gè)組氨酸，His標(biāo)簽?zāi)軌蛱禺愋缘呐cN....

圖5臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖

圖4T細(xì)胞TET2基因敲除驗(yàn)證圖6CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞活力

圖1Cas9蛋白表達(dá)與純化

PBMC中分離純化的T細(xì)胞在電轉(zhuǎn)染2d內(nèi)，細(xì)胞由于電穿孔損傷會(huì)使部分細(xì)胞死亡，活細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)顯示死亡率為42.1%，在培養(yǎng)基中加入IL-2、CD28等細(xì)胞因子的刺激下T細(xì)胞培養(yǎng)2d后開(kāi)始增殖。之前研究表明T細(xì)胞在體外生長(zhǎng)一段時(shí)間，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)T細(xì)胞會(huì)逐漸死亡。在T細(xì)胞中敲除....

圖2Cas9和gRNA體外酶切活性鑒定

T淋巴細(xì)胞作為人體細(xì)胞免疫的重要成分，T細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中數(shù)量最多，其由胸腺內(nèi)的淋巴干細(xì)胞分化而成，為功能最復(fù)雜的一類(lèi)細(xì)胞。T細(xì)胞行使正常功能對(duì)人類(lèi)抵御疾病非常重要，2012年美國(guó)科學(xué)家以HIV病毒為載體將T細(xì)胞進(jìn)行改造使其可以殺傷人體內(nèi)白血病細(xì)胞。CAR-T免疫細(xì)胞治療主要以慢病....

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